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文檔簡介
1、多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)是一類持久性有機(jī)污染物。因其極難降解,雖然全球各國在20世紀(jì)70年代陸續(xù)停產(chǎn)PCBs,但至今仍廣泛存在于環(huán)境中。經(jīng)長期的毒理學(xué)研究證實(shí),多氯聯(lián)苯可經(jīng)動(dòng)物的皮膚、呼吸道和消化道而為機(jī)體所吸收。對(duì)動(dòng)物的毒性影響通常表現(xiàn)在肝臟、皮膚、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等。2013年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,I
2、ARC)將PCBs歸類為人類致癌物?,F(xiàn)有研究資料表明,非二噁英類似PCBs可引起肝癌細(xì)胞的自噬性細(xì)胞死亡,但其對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用還未有深入研究。
自噬(autophagy)是細(xì)胞依賴溶酶體對(duì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的一種過程,其主要作用是清除并降解細(xì)胞內(nèi)受損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、衰老的細(xì)胞器以及不再需要的生物大分子等。自噬作用的機(jī)制失靈將導(dǎo)致細(xì)胞異常甚至死亡。越來越多的證據(jù)表明一些疾病,例如神經(jīng)退行性疾病,腫瘤,感染,器官組織老化和
3、缺血/再灌注等與自噬不足或自噬過度直接相關(guān)。
根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測,非二噁英類似PCBs對(duì)肝臟的毒性作用與其誘導(dǎo)了異常的細(xì)胞自噬有關(guān)。本研究主要探討自噬異常在環(huán)境中常見的非二嗯英類似PCBs(PCB28/PCB52)所致肝細(xì)胞毒性中的作用,為防治多氯聯(lián)苯的環(huán)境污染奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目的:
本研究旨在通過PCB28/PCB52暴露后,檢測大鼠正常肝細(xì)胞(BRL-3A)的細(xì)胞活性、自噬體的形成、自噬通路相關(guān)基因和
4、蛋白的表達(dá)及氧化應(yīng)激水平,探討自噬在PCBs所致肝細(xì)胞毒性中的作用;此外,自噬通路激動(dòng)劑/印制劑使用后,觀察上述指標(biāo)的表達(dá)改變,進(jìn)一步明確PCBs通過引起自噬異常導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性的發(fā)生,為多氯聯(lián)苯環(huán)境污染的防治奠定基礎(chǔ)。
方法:
1.通過CCK-8法觀察細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性。
2.通過透射電鏡證實(shí)BRL-3A細(xì)胞自噬的發(fā)生。
3.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn),研究PCB28/PCB52暴露后,
5、BRL-3A細(xì)胞中自噬相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)。
4.使用免疫熒光觀察細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)位置及表達(dá)量的變化。
5.通過氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)生自噬后的BRL-3A細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。
6.PCB28/PCB52暴露同時(shí),給予自噬激動(dòng)劑Rapamycin/抑制劑3-MA后,檢測BRL-3A細(xì)胞內(nèi)上述指標(biāo)的改變,進(jìn)一步明確自噬異常在PCBs所致肝細(xì)胞毒性中的作用。
結(jié)果:
1.PCB28/PC
6、B52暴露后BRL-3A細(xì)胞活性下降。
2.PCB28/PCB52暴露后BRL-3A細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)目增多。
3.PCB28/PCB52暴露后BRL-3A細(xì)胞中自噬相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)量上升。
4.PCB28/PCB52暴露后BRL-3A細(xì)胞凋亡率增加。
5.PCB28/PCB52暴露后BRL-3A細(xì)胞氧化應(yīng)激水平上升,造成氧化損傷。
6.3-MA與PCB28/PCB52聯(lián)合處理BRL-
7、3A細(xì)胞后其增殖率明顯上升,自噬體數(shù)量明顯減少,自噬相關(guān)基因及蛋白表達(dá)量明顯下降,凋亡率明顯下降,氧化應(yīng)激水平明顯降低;Rapamycin與PCB28/PCB52聯(lián)合處理BRL-3A細(xì)胞后,上述指標(biāo)變化情況與3-MA與PCB28/PCB52聯(lián)合處理相反。
結(jié)論:
PCB28/PCB52對(duì)大鼠肝細(xì)胞有明顯毒性作用,且自噬水平異常是其機(jī)制之一。此外,細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等因素可能與自噬和細(xì)胞毒作用共存,或者可能相互促進(jìn)(需
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