隱丹參酮對SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型氧糖剝奪-復氧糖損傷的干預研究.pdf

1、腦卒中(stroke)是位列世界人類死亡及致殘原因第二位的常見病、多發(fā)病，而急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是最常見的腦卒中類型，給家庭和社會帶來了沉重的負擔。AIS的發(fā)病是以血流以及梗死區(qū)葡萄糖和能量供應的突然中斷為開端，繼而導致嚴重的神經(jīng)功能障礙。盡管隨后的再灌注可以迅速恢復缺血腦組織的正常血供和功能，但也會引起繼發(fā)性損傷，即缺血-再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷。

2、腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)包括一系列的病理級聯(lián)反應：興奮性氨基酸(EAAs)毒性、鈣內流、自由基積聚、炎癥反應、血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞、腦水腫和細胞凋亡等。因此，尋找針對CIRI的防治方法一直是神經(jīng)科學領域的重要任務。
　　腦保護和損傷修復策略對于CIRI的防治具有重要意義。近年來，腦卒中的治療技術和藥物均不斷地發(fā)展

3、、進步，但針對CIRI有效的藥物往往在臨床轉化的過程中遭遇失敗。究其原因在于：其治療的重心僅局限在單一的治療靶點，忽略了不同治療靶點之間的相互作用。因此，急需新的研究策略來預防和治療CIRI。
　　基于上述策略，學者們提出了神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)的概念。NVU可以看作是大腦的基本結構和功能單位，主要結構包括：神經(jīng)元、星形膠質細胞、腦微血管內皮細胞及其基膜、周細胞、小膠質細胞以及細胞外基質。NV

4、U強調了上述細胞之間復雜的相互作用以及它們在大腦病理生理機制中的作用，因此，NVU已成為研究腦卒中多靶點、多水平聯(lián)合治療的重要模型。根據(jù)NVU的概念，本實驗室利用原代培養(yǎng)的SD大鼠大腦皮質毛細血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)、星形膠質細胞和神經(jīng)元三種細胞共培養(yǎng)的方法，構建了一種體外NVU模型——SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型；該模型能夠用于大腦疾病的相關研究、潛在藥物靶

5、點的篩選以及治療藥物的開發(fā)。
　　傳統(tǒng)中草藥以其多作用靶點、高安全性的特點，在治療CIRI方面展現(xiàn)出得天獨厚的優(yōu)勢。丹參是一種廣泛應用于各種心腦血管疾病以及神經(jīng)退行性疾病治療的傳統(tǒng)中草藥，隱丹參酮(cryptotanshinone，CTs)則是從丹參根部提取出的一種重要的丹參酮，它是一種脂溶性的小分子，易于通過BBB?，F(xiàn)代藥理學研究表明，CTs不但具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗凋亡、抗糖尿病及減肥的作用，還具有防治缺血性疾病、

6、動脈粥樣硬化及Alzheimer’s病的作用。近年來，也有學者關注到CTs與I/R損傷之間的關系。已有研究者證實，CTs具有保護心肌I/R損傷和肝I/R損傷的作用；然而CTs對CIRI(特別是在細胞水平)的保護作用及其機制尚未闡明。明確CTs對CIRI的神經(jīng)保護作用可以為腦保護機制的研究以及藥物的篩選提供新的思路。
　　氧糖剝奪/復氧糖(oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/

7、R)是一種常用的、體外模擬CIRI的方法，其病理改變與在體CIRI時腦細胞和BBB的病理改變基本相似。故而，本課題中，我們利用OGD/R損傷的SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型，觀察CTs對SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷的干預作用，并對其可能的干預機制進行深入探討。
　　第一部分 SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型氧糖剝奪/復氧糖損傷模型的建立
　　目的：選擇適宜的OGD/R處理條件，在細胞水平建立一種可靠的、簡便易行的體外

8、NVU的氧糖剝奪/復氧糖(OGD/R)模型，為研究CTs對CIRI的干預作用及其機制的探討奠定基礎。
　　方法：利用體外原代細胞培養(yǎng)技術，提取、培養(yǎng)SD大鼠大腦皮質BMECs、星形膠質細胞和神經(jīng)元，并進行純度鑒定；利用transwell insert將上述三種細胞共培養(yǎng)，在體外構建SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型；設立正常對照組和OGD/R組，每組又分設R0h、0.5h、3h、6h、12h、24h和72h共7個不同復氧糖時間組，各設兩

9、個復孔，OGD/R組采用OGD2h后復氧糖處理；應用試劑盒檢測模型中細胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性和三種細胞的細胞活力；應用ERS-2 System電阻儀，檢測SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型TEER值。
　　結果：
　　1. BMECs原代培養(yǎng)7d后成熟，經(jīng)血管內皮相關因子VIII抗體免疫熒光染色鑒定，細胞純度>95%。
　　2.星形膠質細胞原代培養(yǎng)10d后傳代，第二代培養(yǎng)

10、9d成熟，經(jīng)GFAP免疫熒光染色鑒定，細胞純度>90%。
　　3.神經(jīng)元原代培養(yǎng)7 d后成熟，經(jīng)MAP2免疫熒光染色鑒定，細胞純度>90%。
　　4.利用transwell insert將BMECs、星形膠質細胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)，共培養(yǎng)的第3 d到第5 d，TEER值趨于穩(wěn)定(P>0.05)。
　　5. SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD2h處理后，開始復氧糖(R)處理：(1)R3h時：神經(jīng)元的細胞活力開始下降(P＜0.

11、01)，且R24h和R72h時較R3h時下降得更顯著(P均＜0.01)。(2)R6h時：BMECs和星形膠質細胞的存活率才開始下降(P均＜0.05)，且R24h和R72h時較R6h時下降得更顯著(P均＜0.01)；細胞培養(yǎng)液LDH活性開始增加(P＜0.01)，且R24h和R72h時較R6h時增加得更顯著(P均＜0.01)；TEER值開始下降(P＜0.05)，且R12h、R24h和R72h時較R6h時下降得更為顯著(P分別為＜0.05，＜

12、0.01和＜0.01)。
　　結論：
　　1. SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型經(jīng)OGD2h/R24h處理后，被成功地構建為OGD/R損傷模型。
　　2. TEER值的降低可作為判斷SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷模型成功構建的檢測指標。
　　第二部分隱丹參酮對SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型氧糖剝奪/復氧糖損傷的干預作用
　　目的：觀察CTs對SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷的干預作用，驗證C

13、Ts對CIRI的神經(jīng)保護作用。
　　方法：(1)利用成功構建的SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型，將0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、50和100μM共9種不同濃度CTs作用于模型24 h后，用CCK-8的方法，檢測模型中神經(jīng)元的毒性，選擇適宜的CTs濃度。(2)利用SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型，設立預處理給藥組和即刻給藥組，每個組再分設正常對照組和各適宜CTs濃度組，各設3個復孔，除正常對照組之外均采用OGD2h/R

14、24h處理；應用LDH檢測試劑盒，檢測OGD/R損傷后的細胞損傷程度，確定最佳給藥方式和有效劑量。(3)利用SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型，設立正常對照組、OGD2h/R24h組、CTs2.5μM組和CTs5.0μM組，各設3個復孔，除正常對照組之外均采用OGD2h/R24h處理；倒置顯微鏡下觀察模型中三種細胞的細胞形態(tài)；應用檢測試劑盒，檢測模型中三種細胞的細胞活力及細胞損傷程度的干預作用。
　　結果：
　　1.不同濃度的CT

15、s作用于SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型24 h后，0.2、0.5、1.0、2.5、5.0和10μM CTs對神經(jīng)元細胞活力無明顯影響(P>0.05)。
　　2.預處理給藥組中，與OGD2h/R24h組相比，CTs1.0、2.5、5.0和10μM組LDH活性均明顯降低(P分別為＜0.05，0.01，0.01和0.05)。即刻給藥組中，與OGD2h/R24h組相比，各CTs組LDH活性無明顯差異(P均>0.05)。
　　3.無論是

16、CTs2.5μM組還是CTs5.0μM組均可修復OGD/R損傷所造成的BMECs、星形膠質細胞和神經(jīng)元的各種病理性形態(tài)學改變，明顯提高三種細胞的細胞活力(P均＜0.01)，降低細胞培養(yǎng)液LDH活性(P分別為＜0.05和＜0.01)。
　　結論：
　　1. CTs對SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷的最佳給藥方式為預處理給藥，有效劑量為2.5和5.0μM。
　　2. CTs預處理能夠恢復OGD/R損傷引起的細胞收

17、縮，減少細胞脫落，提高細胞活力，減少細胞損傷，對SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷具有保護作用。
　　第三部分隱丹參酮對SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型氧糖剝奪/復氧糖損傷的干預作用機制
　　目的：探討CTs對SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷的干預作用機制，為腦保護機制的研究以及藥物的篩選提供新的思路。
　　方法：利用SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型，設立正常對照組、OGD2h/R24h組、CTs2.5μM組

18、和CTs5.0μM組，各設3個復孔，除正常對照組之外均采用OGD2h/R24h處理；應用檢測試劑盒，檢測神經(jīng)元內ROS含量以及細胞培養(yǎng)液中MDA含量、SOD活力和NO含量；應用ELISA法，檢測細胞培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量；應用TUNEL法，檢測神經(jīng)元的細胞凋亡率；應用ERS-2 System電阻儀，檢測TEER值；應用熒光化學發(fā)光檢測儀，檢測BMECs對NaF的通透量；應用Western blot法，檢測 CTs

19、對 OGD/R損傷后神經(jīng)元的Caspase-3、cleaved-Caspase-3、PARP、cleaved-PARP、Bax、Bcl-2和MAPKs表達以及BMECs的ZO-1、Occludin、Claudin-5、MMP-2和MMP-9表達的影響。
　　結果：
　　1. CTs預處理可使SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷后神經(jīng)元內的ROS水平、細胞培養(yǎng)液中的MDA和NO水平降低(P均＜0.01)，而使細胞培養(yǎng)液中

20、的SOD活力增高(P＜0.01)。
　　2. CTs預處理可使SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷后細胞培養(yǎng)液中的促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平降低(P均＜0.01)。
　　3. CTs預處理可使SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷后神經(jīng)元細胞凋亡率降低(P＜0.01)，cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP的表達降低(P均＜0.01)。
　　4. CTs預處理可使SD大

21、鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷后神經(jīng)元Bcl-2的表達增加、Bax的表達降低(P均＜0.01)，從而使Bcl-2/Bax比值增大；
　　5.CTs預處理可使SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷后神經(jīng)元p-JNK和p-p38 MAPK的表達降低(P均＜0.01)。
　　6. CTs預處理可使SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷后TEER值增高(P＜0.01)，BMECs對NaF的通透量降低(P＜0.01)；B

22、MECs中ZO-1、Occludin和Claudin-5表達增加，而MMP-9表達降低(P均＜0.01)。
　　結論：
　　1. CTs對SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型OGD/R損傷的干預作用與抗氧化、抗炎、抗神經(jīng)元凋亡以及改善BBB功能的機制有關。
　　2. CTs抑制SD大鼠重要大腦細胞網(wǎng)絡模型中OGD/R損傷神經(jīng)元凋亡的機制可能與上調Bcl-2/Bax表達以及抑制JNK和p38 MAPK信號通路相關。
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