內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子CHOP在蛋白尿誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、大量蛋白尿是慢性腎病(chronickidneydisease,CKD)最常見的臨床表現(xiàn)之一，它不僅是反映腎小球損傷程度的重要標(biāo)志，還可以引起腎小管間質(zhì)損傷促使腎臟病變持續(xù)進(jìn)展，是CKD病程進(jìn)展中的一個獨立危險因素。白蛋白是腎小球疾病蛋白尿中的主要成分。研究表明，白蛋白超負(fù)荷可激活腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、生長因子以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等；還可介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化發(fā)生。研究表明，腎小管上皮細(xì)胞過度

2、凋亡是腎小管萎縮的重要病理生理基礎(chǔ)之一。目前，較為肯定的蛋白尿誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要有：死亡受體通路(Fas-FADD-caspase8)途徑、過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR-γ)途徑、NF-κB途徑以及線粒體凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress，ERS)啟動的凋亡途徑是近年才發(fā)現(xiàn)的一條新的凋亡途徑，它通過PERK(PKR-likeERkinase)、ATF6(activatingtr

3、anscriptionfactor6)以及IRE-1(inositolrequiringkinase1)三個信號通路激活下游的凋亡信號分子如CHOP(CCAAT/enhancer-bindingprotei-homologousprotein，也稱為GADD153)、c-Jun氨基酸末端激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)、caspase-12以及Bcl-2家族等靶基因?qū)е录?xì)胞凋亡。越來越多的研究證明，ERS誘導(dǎo)的

4、細(xì)胞凋亡在腫瘤、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性變及心血管疾病等很多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起十分重要的作用。但是，對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑在慢性腎病進(jìn)程中的作用及機(jī)制所知甚少。 CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子，屬C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活CHOP是引起細(xì)胞凋亡最重要的信號途徑。PERK、ATF6以及IRE-1的活化都誘導(dǎo)CHOP轉(zhuǎn)錄，其中，PERK在CHOP蛋白表達(dá)中其關(guān)鍵作用。有研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑衣霉素可以

5、顯著上調(diào)腎組織CHOP基因表達(dá)，引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡和腎組織損傷，CHOP基因缺乏小鼠的腎小管上皮細(xì)胞對衣霉素的作用則表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡反應(yīng)降低，均提示CHOP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的腎損傷中具有十分重要的作用。據(jù)此，我們推測：蛋白尿可能通過活化CHOP誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡；PERK的激活可能是調(diào)控這一病理生理過程的主要環(huán)節(jié)。本課題總體思路如下圖所示： 一、實驗方法 (一)慢性腎病患者腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

6、 1.研究對象根據(jù)1999年美國腎臟病基金會(NKF)公布的新的CKD定義，選取本院住院患者經(jīng)臨床和腎活檢確診為CKD的病例21例，并按照患者24h尿蛋白定量水平將病例分為：輕度蛋白尿組(＜1.5g/24h，7例，其中IgA腎病4例，系膜增生性腎小球腎炎3例)、中度蛋白尿組(1.5～3.5g/24h，7例，其中IgA腎病4例，系膜增生性腎小球腎炎3例)、重度蛋白尿組(＞3.5g/24h，7例，其中IgA腎病3例，系膜增生性腎小球腎

7、炎4例)。對照組7例，均取自腎腫瘤患者切除腎臟的遠(yuǎn)離腫瘤部分并經(jīng)病理檢查證實為正常腎組織，尿檢蛋白＜150mg/24h。 2.檢測指標(biāo)及方法常規(guī)生化方法檢測血漿白蛋白、脂蛋白、肌酐及24小時尿蛋白定量，HE、PAS、PASM以及Masson染色觀察腎組織學(xué)改變，腎小管上皮細(xì)胞ORP150、GRP78及CHOP表達(dá)采用免疫組化方法檢測，細(xì)胞凋亡采用TUNEL法檢測。 (二)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子CHOP在白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)腎小管

8、上皮細(xì)胞凋亡中的作用及其調(diào)控機(jī)制 1.白蛋白超負(fù)荷對腎小管上皮細(xì)胞GRP78、CHOP、PERK表達(dá)，PERK磷酸化及細(xì)胞凋亡的影響 (1)分別以0、5、10、20mg/ml的白蛋白刺激HKC細(xì)胞24小時，用westernblot方法檢測GRP78、CHOP、PERK蛋白表達(dá)水平以及PERK磷酸化水平，觀察它們與白蛋白作用的量效關(guān)系；采用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠(AnnexinV-FITC/PI)雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

9、變化。 (2)以20mg/ml白蛋白刺激HKC細(xì)胞12、24、36小時，以0mg/ml白蛋白刺激HKC細(xì)胞0、24小時為對照，用westernblot方法檢測GRP78、CHOP、PERK蛋白表達(dá)水平以及PERK磷酸化水平，觀察它們與白蛋白作用的時效關(guān)系；采用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠(AnnexinV-FITC/PI)雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡變化。 2.CHOP基因沉默對白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

10、(1)采用RT-PCR檢測CHOPsiRNA對白蛋白誘導(dǎo)HKC細(xì)胞CHOPmRNA表達(dá)的抑制作用。 (2)采用westernblot方法，檢測CHOPsiRNA對白蛋白誘導(dǎo)HKC細(xì)胞CHOP、PERK蛋白表達(dá)及PERK磷酸化的影響。 (3)采用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠(AnnexinV-FITC/PI)雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測CHOPsiRNA對白蛋白誘導(dǎo)HKC細(xì)胞凋亡的影響。 3.PERK基因沉默對白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)腎小

11、管上皮細(xì)胞CHOP表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響 (1)采用RT-PCR檢測PERKsiRNA對白蛋白誘導(dǎo)HKC細(xì)胞CHOPmRNA及PERKmRNA表達(dá)的抑制作用。 (2)采用westernblot方法，檢測PERKsiRNA對白蛋白誘導(dǎo)HKC細(xì)胞CHOP、PERK蛋白表達(dá)及PERK磷酸化的影響。 (3)采用膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠(AnnexinV-FITC/PI)雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測PERKsiRNA對白蛋白誘導(dǎo)HKC細(xì)

12、胞凋亡的影響。 二、實驗結(jié)果 (一)慢性腎病患者腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的關(guān)系對照組腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)ORP150、GRP78、CHOP呈極低水平的表達(dá)。CKD患者腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)ORP150、GRP78表達(dá)顯著增加(P＜0.01)；胞核內(nèi)CHOP表達(dá)呈強(qiáng)陽性(P＜0.01)；細(xì)胞凋亡亦明顯增多(P＜0.01)；相關(guān)性分析表明，ORP150、GRP78、CHOP的表達(dá)及細(xì)胞凋亡均與24小時尿蛋白量呈正相關(guān)

13、(r=0.695，r=0.760，r=0.753，r=0.835，P＜0.01)。各組間腎小管上皮細(xì)胞CHOP表達(dá)與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)(r=0.765，P＜0.01)。 (二)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子CHOP在白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用及其調(diào)控機(jī)制 1.白蛋白超負(fù)荷與腎小管上皮細(xì)胞GRP78、CHOP、PERK表達(dá)，PERK磷酸化及細(xì)胞凋亡的量效及時效關(guān)系 (1)腎小管上皮細(xì)胞GRP78、CHOP、PER

14、K表達(dá)，PERK磷酸化及細(xì)胞凋亡隨白蛋白濃度增加而進(jìn)行性上調(diào)(P＜0.01)。 (2)以20mg/ml白蛋白刺激HKC細(xì)胞，GRP78、CHOP、PERK，PERK磷酸化及細(xì)胞凋亡隨培養(yǎng)時間延長而進(jìn)行性增加(P＜0.01)。 2.CHOP基因沉默對白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響CHOPsiRNA顯著抑制白蛋白誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞CHOPmRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)(P＜0.01)，對PERK蛋白表達(dá)無明顯影響，對PERK

15、磷酸化有顯著的上調(diào)作用(P＜0.01)，同時，對白蛋白誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡有顯著的抑制作用(P＜0.01)。 3.PERK基因沉默對白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞CHOP表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響PERKsiRNA顯著抑制白蛋白誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞CHOPmRNA、PERKmRNA表達(dá)及它們的蛋白表達(dá)(P＜0.01)，對白蛋白誘導(dǎo)PERK磷酸化有顯著的抑制作用(P＜0.01)，同時，對白蛋白誘導(dǎo)的HKC細(xì)胞凋亡有顯著的抑制作用(P＜0.0

16、1)。 三、結(jié)論 1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激可能參與了CKD患者腎小管上皮細(xì)胞的損傷。CHOP的表達(dá)上調(diào)及核轉(zhuǎn)位可能與蛋白尿誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。 2.白蛋白呈時間、劑量依賴性上調(diào)HKC細(xì)胞GRP78、CHOP、PERK表達(dá)及PERK磷酸化，與細(xì)胞凋亡增多的變化規(guī)律一致，提示PERK-CHOP途徑可能與白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)HKC細(xì)胞凋亡有關(guān)。 3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)上調(diào)可能是白蛋白超負(fù)荷誘導(dǎo)的