miR-155對(duì)MST2的靶向抑制在血管重塑中的作用及機(jī)制.pdf

1、哺乳動(dòng)物Ste20樣激酶2（mammalian sterile20-like kinase2，MST2）作為Hippo通路的核心組件，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究利用小鼠股動(dòng)脈損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生模型，探討MST2在miR-155介導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激發(fā)生發(fā)展中的作用，旨在為闡明miR-155在血管重塑中的作用機(jī)制以及藥物開發(fā)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 miR-155

2、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管內(nèi)膜增生
　　目的:探討miR-155對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其在新生內(nèi)膜形成中的作用。
　　方法:1.過(guò)表達(dá)或敲低血管平滑肌細(xì)胞中的miR-155，Western blot檢測(cè)增殖標(biāo)志基因，細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTS測(cè)定細(xì)胞增殖。2.對(duì)miR-155基因敲除(miR-155-/-)小鼠和野生型(WT)小鼠進(jìn)行右則股動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷。蘇木精-伊紅染色（HE）觀察和評(píng)價(jià)內(nèi)膜增生的形態(tài)學(xué)改變。3.實(shí)時(shí)定量

3、PCR(qRT-PCR)檢測(cè)WT及miR-155-/-鼠股動(dòng)脈損傷前后miR-155的表達(dá)。4.野生型小鼠股動(dòng)脈損傷后原位過(guò)表達(dá)miR-155、原位轉(zhuǎn)染miR-155激動(dòng)劑及抑制劑，HE染色驗(yàn)證內(nèi)膜增生的形態(tài)學(xué)改變。5.SM22α聯(lián)合MAC2免疫雙熒光染色觀察平滑肌細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。6.SM22α聯(lián)合miR-155熒光探針原位雜交定位miR-155的表達(dá)。7.TUNEL染色和Westernblot檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-155對(duì)血管平滑

4、肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.過(guò)表達(dá)和敲低miR-155分別促進(jìn)或抑制體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞增殖。
　　2.miR-155遺傳性缺失顯著抑制導(dǎo)絲損傷所誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生。
　　3.原位過(guò)表達(dá)miR-155促進(jìn)導(dǎo)絲損傷所誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生。
　　4.原位轉(zhuǎn)染miR-155激動(dòng)劑促進(jìn)、轉(zhuǎn)染抑制劑減少導(dǎo)絲損傷所誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生。
　　5.在損傷的血管中miR-155主要來(lái)源于平滑肌細(xì)胞。

5、>　　6.過(guò)表達(dá)miR-155抑制H2O2誘導(dǎo)的血管平滑肌凋亡。
　　小結(jié):
　　miR-155促進(jìn)體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和抑制由H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;遺傳敲除miR-155顯著降低導(dǎo)絲損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生;miR-155功能獲得或缺失實(shí)驗(yàn)均證實(shí)miR-155在血管平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
　　第二部分 miR-155通過(guò)靶向抑制MST2促進(jìn)炎癥和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖和重

6、塑
　　目的:揭示miR-155通過(guò)靶向抑制MST2進(jìn)而促進(jìn)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)及導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管重塑的作用機(jī)制。
　　方法:1.通過(guò)miRanda和RNAhybrid兩網(wǎng)站對(duì)細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。2.合成靶基因3'非編碼序列(UTR)及其突變體并連接到pmir-GLO雙熒光報(bào)告質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞并進(jìn)行雙熒光報(bào)告基因活性檢測(cè)。3.血管平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲低miR-155，Western blot檢

7、測(cè)MST2和TRIM39的表達(dá)。4.對(duì)WT和miR-155-/-小鼠股動(dòng)脈導(dǎo)絲損傷組織進(jìn)行MST2和SM22α免疫雙熒光染色。5.qRT-PCR檢測(cè)損傷組織中炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。6.在血管平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-155的同時(shí)過(guò)表達(dá)MST2，檢測(cè)MST2介導(dǎo)miR-155對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　1.在血管平滑肌細(xì)胞中MST2是miR-155的直接靶基因。
　　2.miR-155靶向抑制M

8、ST2促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移。
　　3.miR-155靶向抑制MST2促進(jìn)NF-κB、TNF-α、p47phox和HO-1表達(dá)。
　　小結(jié):
　　miR-155通過(guò)靶向抑制MST2促進(jìn)炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和血管重塑。
　　第三部分 miR-155通過(guò)靶向抑制MST2進(jìn)而激活Raf-1-MEK-ERK1/2信號(hào)途徑及整合炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)
　　目的:探索miR

9、-155通過(guò)靶向抑制MST2從而調(diào)節(jié)炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)及平滑肌細(xì)胞增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
　　方法:1.分別在血管平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲低miR-155，Westernblot檢測(cè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路及炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)。2.用siRNA敲低內(nèi)源性MST2，檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)。3.過(guò)表達(dá)miR-155的同時(shí)敲低MST2，或抑制miR-155的同時(shí)敲低MST2，Western b

10、lot檢測(cè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)。4.敲低內(nèi)源性MST2后，分別用不同信號(hào)通路特異性抑制劑處理細(xì)胞，Western blot檢測(cè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路、炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)。5.在血管平滑肌細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)或敲低miR-155后，免疫共沉淀檢測(cè)MST2、MEK、Raf-1相互作用。6.報(bào)告基因檢測(cè)NF-κB對(duì)miR-155啟動(dòng)子活性的影響。7.qRT-PCR檢測(cè)損傷血管組織中PDGF mRNA的表達(dá)

11、水平。
　　結(jié)果:
　　1.miR-155通過(guò)靶向抑制MST2而活化細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)途徑ERK1/2
　　在血管平滑肌細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)或敲低miR-155，Western blot檢測(cè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-155顯著下調(diào)MST2表達(dá)并增加PI3K/Akt和ERK1/2的磷酸化，但不影響JNK和p38的磷酸化。相反，與轉(zhuǎn)染對(duì)照miRNA相比，血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-155后，ERK

12、1/2的磷酸化水平顯著下降;然而，PI3K/Akt、JNK和p38的磷酸化水平?jīng)]有明顯的改變。Western blot結(jié)果顯示，在同時(shí)敲低MST2和miR-155的細(xì)胞中，ERK1/2的磷酸化水平升高，PI3K/Akt的磷酸化水平?jīng)]影響， PCNA蛋白水平增加。與單純過(guò)表達(dá)miR-155相比，當(dāng)在血管平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-155的同時(shí)敲低MST2時(shí)， ERK1/2的磷酸化水平進(jìn)一步增加。這些結(jié)果表明，miR-155通過(guò)靶向抑制MST

13、2而活化ERK1/2信號(hào)途徑，進(jìn)而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　2.miR-155通過(guò)靶向抑制MST2表達(dá)整合炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)
　　Western blot結(jié)果顯示，在血管平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-155可促進(jìn)p47phox和NF-κB表達(dá);與此相反，敲低miR-155下調(diào)這些蛋白質(zhì)的表達(dá)。單純敲低MST2使p47phox和NF-κB總蛋白及其磷酸化水平升高，但同時(shí)敲低MST2和miR-155時(shí)，則下調(diào)這些蛋白質(zhì)的水平。

14、相反，單純過(guò)表達(dá)MST2使p47phox和NF-κB總蛋白及其磷酸化水平降低，但過(guò)表達(dá)MST2的同時(shí)也過(guò)表達(dá)miR-155時(shí)，又恢復(fù)了這些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，miR-155通過(guò)MST2來(lái)調(diào)節(jié)p47phox和NF-κB的表達(dá)，MST2將炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)整合在一起。
　　3.MST2通過(guò)Raf-1-MEK-ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)miR-155介導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　在血管平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-155后

15、進(jìn)行免疫共沉淀分析的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-155顯著增加Raf-1免疫沉淀復(fù)合物中MEK水平，降低MST2水平。相反， miR-155拮抗劑增加Raf-免疫沉淀復(fù)合物中的MST2，減少M(fèi)EK。miR-155的過(guò)表達(dá)促進(jìn)MEK和ERK/2磷酸化，而miR-155拮抗劑抑制這兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的磷酸化。
　　4.miR-155、NF-κB和PDGF之間形成正反饋環(huán)路
　　報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)N

16、F-κB顯著增加miR-155/BIC啟動(dòng)子的活性。同時(shí)，在血管平滑肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NF-κB后，也顯著增加miR-155基因的表達(dá)。對(duì)損傷的血管進(jìn)行PDGF基因表達(dá)檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-155-/-小鼠PDGF基因的表達(dá)水平顯著低于野生型小鼠，與原位轉(zhuǎn)染Ad-GFP組相比，原位過(guò)表達(dá)miR-155能顯著增加PDGF基因的表達(dá)水平。
　　小結(jié):
　　miR-155靶向抑制MST2，減少M(fèi)ST2與Raf-1的相互作用，使Raf-1

17、與MEK結(jié)合增加，進(jìn)而激活ERK1/2信號(hào)通路，并整合炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1.miR-155促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。
　　2.miR-155在血管平滑肌細(xì)胞增殖和新生內(nèi)膜形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
　　3.在血管平滑肌細(xì)胞中MST2是miR-155的直接靶基因。
　　4.miR-155通過(guò)靶向抑制MST2促進(jìn)炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和血管