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文檔簡介
1、目的:
糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)主要的微血管并發(fā)癥之一,以高血壓、蛋白尿和進行性腎功能喪失為特征,是導致終末期腎病(End stage renal disease,ESRD)的重要原因。DN有多種發(fā)病機制,但大量研究表明腎小球足細胞的損傷在DN發(fā)生發(fā)展中占重要地位。本實驗將不同劑量雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii p
2、olyglucoside,TWP)以及聯合小檗堿(Berberine,BBR)預防性和治療性應用于高糖高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)注射模擬的T2DM和DN大鼠動物模型,探討雷公藤多苷、小檗堿及聯合用藥對DN腎小球足細胞及相關因子的干預作用及可能的機制。
方法:
清潔級雄性SD大鼠260只,隨機選取20只分為預防正常對照組(PNC組)10只、治療正常對照組(TNC組)10只,飼
3、以常規(guī)飼料;其余240只大鼠以高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周聯合小劑量STZ尾靜脈注射建立T2DM模型,將成模大鼠隨機分為預防(P)組與治療(T)組。預防組包括:模型對照預防組(PDM組)、雷公藤多苷低、中、高劑量預防組(PTL組TWP1mg/kg·d、PTM組TWP3mg/kg·d、PTH組TWP6mg/kg·d)、小檗堿預防組(PB組BBR150mg/kg·d)、雷公藤多苷低、中、高劑量聯合小檗堿預防組(PTBL組TWP1mg/kg·d+BB
4、R150mg/kg·d、PTBM組TWP3mg/kg·d+BBR150mg/kg·d、PTBH組TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)。治療組包括:模型對照治療組(TDM組)、雷公藤多苷低、中、高劑量治療組(TTL組TWP3mg/kg·d、TTM組TWP6mg/kg·d、TTH組TWP9mg/kg·d)、小檗堿治療組(TB組BBR150mg/kg·d)、雷公藤多苷低、中、高劑量聯合小檗堿治療組(TTBL組TWP3mg/kg
5、·d+BBR150mg/kg·d、TTBM組TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d、TTBH組TWP9mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)。每組15只。預防組于成模后即開始灌胃,治療組于成模后第7周開始灌胃,均灌胃8周后處死。實驗過程中記錄大鼠體重、血糖、24小時尿微量白蛋白變化。STZ注射前內眥取血測血脂、空腹胰島素。實驗結束時:①留取血標本用于肝腎功能、血脂、血常規(guī)測定以及ELISA法檢測血清Nephrin、VE
6、GF水平的變化;②記錄腎臟重量(KW),留取腎組織。電鏡觀察足細胞病理變化。免疫組化法觀察Nephrin、VEGF在腎小球的表達;RT-PCR法檢測Nephrin、VEGF的mRNA表達水平;Western Blotting法檢測Nephrin、VEGF的蛋白表達量。
結果:
1、造模結果:高糖高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠8周后甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、空腹胰島素(FINS)較正常對照組明顯升高(P<0.05);STZ
7、注射后,糖尿病各組大鼠血糖明顯升高,體重顯著下降,出現“三多一少”等癥狀。治療組大鼠自成模后第6周末UMA水平明顯高于正常對照組(P<0.05)。
2、一般指標:①體重、血糖:灌胃8周末,與PNC、TNC相比,糖尿病組與各干預用藥組大鼠體重均明顯下降(P<0.05),血糖均明顯升高(P<0.05),雷公藤多苷和小檗堿灌胃對大鼠體重、血糖無顯著影響(P>0.05)。②血脂:灌胃8周末,與PNC、TNC相比,糖尿病組與各干預用藥組
8、大鼠TG、TC均明顯升高(P<0.05),雷公藤多苷和小檗堿灌胃后無顯著影響(P>0.05)。③灌胃8周末,肝功能、腎功能、血常規(guī)在各組間均無明顯差異(P>0.05),雷公藤多苷和小檗堿灌胃后無顯著影響(P>0.05)。
3、24h尿微量白蛋白(UMA):①預防組:與PDM組相比,雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠UMA水平均有顯著性下降(P<0.05),且呈劑量依賴性;中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、
9、PTBH)下降最明顯(P<0.05)。②治療組:與TDM組相比,雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組UMA水平有顯著性下降(P<0.05),且呈劑量依賴性;中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)下降最明顯(P<0.05),小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P>0.05)。
4、腎重指數(KW/BW):①預防組:與PDM組相比,雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠KW/BW水平均有顯著性下降(P<0
10、.05);PTH組下降最明顯(P<0.05)。②治療組:與TDM組相比,TTH、TB、TTBL、TTBM和TTBH組有明顯下降(P<0.05)。
5.電鏡觀察腎組織病理結構變化:①預防組:PDM組腎小球足細胞足突融合,細胞膜破裂。與PDM組相比,雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組病理改變均減輕,且呈劑量依賴性;中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯。②治療組:TDM組大鼠腎小球足突融合,細胞膜
11、破裂。與TDM組相比,雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組上述病理改變均減輕,且呈劑量依賴性;中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)改善最明顯。
6、采用ELISA技術檢測大鼠血清Nephrin、VEGF水平:①預防組:與PDM組相比,雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠血清Nephrin水平無明顯差異(P>0.05);血清VEGF水平均有顯著性下降(P<0.05),且呈劑量依賴性,中、高劑量組(P
12、TM、PTH、PTBM、PTBH)下降最明顯(P<0.05)。②治療組:與TDM組相比,雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組大鼠血清Nephrin水平無明顯差異(P>0.05);血清VEGF水平均有顯著性下降(P<0.05),且呈劑量依賴性,中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)下降最明顯(P<0.05),小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P>0.05)。
7、采用免疫組化技術檢測大鼠腎臟Nephrin、VEG
13、F蛋白表達水平:①預防組:與PDM組相比,雷公藤多昔、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠腎臟腎小球足細胞Nephrin免疫染色逐漸增強,腎小球VEGF免疫染色逐漸減弱,且呈劑量依賴性,中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯。②治療組:與TDM組相比,雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組大鼠腎臟腎小球足細胞Nephrin免疫染色逐漸增強,腎小球VEGF免疫染色逐漸減弱,且呈劑量依賴性,中、高劑量組(TTM、TT
14、H、TTBM、TTBH)改善最明顯。
8.采用RT-PCR技術檢測大鼠腎臟Nephrin、VEGF mRNA表達水平:①預防組:與PDM組相比,雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠腎臟Nephrin mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05),VEGF mRNA表達水平均有顯著性下降(P<0.05),且呈劑量依賴性,中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯(P<0.05)。②治療組:與TDM組
15、相比,雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組大鼠腎臟Nephrin mRNA表達水平均顯著升高(P<0.05),VEGF mRNA表達水平均有顯著性下降(P<0.05),且呈劑量依賴性,中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)改善最明顯(P<0.05),小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P>0.05)。
9、采用Western Blotting技術檢測大鼠腎臟Nephrin、VEGF蛋白表達量:①預防組:與PDM組
16、相比,雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠腎臟Nephrin蛋白表達量均顯著升高(P<0.05),VEGF蛋白表達量均有顯著性下降(P<0.05),且呈劑量依賴性,中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯(P<0.05)。②治療組:與TDM組相比,雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組大鼠腎臟Nephrin蛋白表達量均顯著升高(P<0.05),VEGF蛋白表達量均有顯著性下降(P<0.05),且呈劑量依
17、賴性,中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)改善最明顯(P<0.05),小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P>0.05)。
結論
1、本實驗成功制備2型糖尿病和DN大鼠模型。
2、應用中劑量、高劑量雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿早期預防和治療DN,可顯著降低尿蛋白水平。
3、DN大鼠血清和腎臟中Nephrin的表達水平較正常對照組明顯下降,VEGF的表達水平較正常對照組明顯升高,提
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