雷公藤多苷聯合小檗堿對糖尿病腎病大鼠腎小球足細胞相關因子的干預研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)主要的微血管并發(fā)癥之一，以高血壓、蛋白尿和進行性腎功能喪失為特征，是導致終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)的重要原因。DN有多種發(fā)病機制，但大量研究表明腎小球足細胞的損傷在DN發(fā)生發(fā)展中占重要地位。本實驗將不同劑量雷公藤多苷（Tripterygium wilfordii p

2、olyglucoside，TWP）以及聯合小檗堿（Berberine，BBR）預防性和治療性應用于高糖高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）注射模擬的T2DM和DN大鼠動物模型，探討雷公藤多苷、小檗堿及聯合用藥對DN腎小球足細胞及相關因子的干預作用及可能的機制。
　　方法：
　　清潔級雄性SD大鼠260只，隨機選取20只分為預防正常對照組（PNC組）10只、治療正常對照組（TNC組）10只，飼

3、以常規(guī)飼料;其余240只大鼠以高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周聯合小劑量STZ尾靜脈注射建立T2DM模型，將成模大鼠隨機分為預防(P)組與治療(T)組。預防組包括:模型對照預防組（PDM組）、雷公藤多苷低、中、高劑量預防組（PTL組TWP1mg/kg·d、PTM組TWP3mg/kg·d、PTH組TWP6mg/kg·d）、小檗堿預防組（PB組BBR150mg/kg·d）、雷公藤多苷低、中、高劑量聯合小檗堿預防組(PTBL組TWP1mg/kg·d+BB

4、R150mg/kg·d、PTBM組TWP3mg/kg·d+BBR150mg/kg·d、PTBH組TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)。治療組包括:模型對照治療組（TDM組）、雷公藤多苷低、中、高劑量治療組(TTL組TWP3mg/kg·d、TTM組TWP6mg/kg·d、TTH組TWP9mg/kg·d)、小檗堿治療組（TB組BBR150mg/kg·d）、雷公藤多苷低、中、高劑量聯合小檗堿治療組(TTBL組TWP3mg/kg

5、·d+BBR150mg/kg·d、TTBM組TWP6mg/kg·d+BBR150mg/kg·d、TTBH組TWP9mg/kg·d+BBR150mg/kg·d)。每組15只。預防組于成模后即開始灌胃，治療組于成模后第7周開始灌胃，均灌胃8周后處死。實驗過程中記錄大鼠體重、血糖、24小時尿微量白蛋白變化。STZ注射前內眥取血測血脂、空腹胰島素。實驗結束時:①留取血標本用于肝腎功能、血脂、血常規(guī)測定以及ELISA法檢測血清Nephrin、VE

6、GF水平的變化;②記錄腎臟重量(KW)，留取腎組織。電鏡觀察足細胞病理變化。免疫組化法觀察Nephrin、VEGF在腎小球的表達;RT-PCR法檢測Nephrin、VEGF的mRNA表達水平;Western Blotting法檢測Nephrin、VEGF的蛋白表達量。
　　結果：
　　1、造模結果:高糖高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠8周后甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、空腹胰島素(FINS)較正常對照組明顯升高(P＜0.05);STZ

7、注射后，糖尿病各組大鼠血糖明顯升高，體重顯著下降，出現“三多一少”等癥狀。治療組大鼠自成模后第6周末UMA水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)。
　　2、一般指標:①體重、血糖:灌胃8周末，與PNC、TNC相比，糖尿病組與各干預用藥組大鼠體重均明顯下降(P＜0.05)，血糖均明顯升高(P＜0.05)，雷公藤多苷和小檗堿灌胃對大鼠體重、血糖無顯著影響（P＞0.05）。②血脂:灌胃8周末，與PNC、TNC相比，糖尿病組與各干預用藥組

8、大鼠TG、TC均明顯升高(P＜0.05)，雷公藤多苷和小檗堿灌胃后無顯著影響(P＞0.05)。③灌胃8周末，肝功能、腎功能、血常規(guī)在各組間均無明顯差異(P＞0.05)，雷公藤多苷和小檗堿灌胃后無顯著影響(P＞0.05)。
　　3、24h尿微量白蛋白(UMA):①預防組:與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠UMA水平均有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性;中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、

9、PTBH)下降最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組UMA水平有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性;中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)下降最明顯(P＜0.05)，小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P＞0.05)。
　　4、腎重指數(KW/BW):①預防組:與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠KW/BW水平均有顯著性下降（P＜0

10、.05）;PTH組下降最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組相比，TTH、TB、TTBL、TTBM和TTBH組有明顯下降（P＜0.05)。
　　5.電鏡觀察腎組織病理結構變化:①預防組:PDM組腎小球足細胞足突融合，細胞膜破裂。與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組病理改變均減輕，且呈劑量依賴性;中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯。②治療組:TDM組大鼠腎小球足突融合，細胞膜

11、破裂。與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組上述病理改變均減輕，且呈劑量依賴性;中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)改善最明顯。
　　6、采用ELISA技術檢測大鼠血清Nephrin、VEGF水平:①預防組:與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠血清Nephrin水平無明顯差異(P＞0.05);血清VEGF水平均有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(P

12、TM、PTH、PTBM、PTBH)下降最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組大鼠血清Nephrin水平無明顯差異(P＞0.05);血清VEGF水平均有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)下降最明顯(P＜0.05)，小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P＞0.05)。
　　7、采用免疫組化技術檢測大鼠腎臟Nephrin、VEG

13、F蛋白表達水平:①預防組:與PDM組相比，雷公藤多昔、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠腎臟腎小球足細胞Nephrin免疫染色逐漸增強，腎小球VEGF免疫染色逐漸減弱，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯。②治療組:與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組大鼠腎臟腎小球足細胞Nephrin免疫染色逐漸增強，腎小球VEGF免疫染色逐漸減弱，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(TTM、TT

14、H、TTBM、TTBH)改善最明顯。
　　8.采用RT-PCR技術檢測大鼠腎臟Nephrin、VEGF mRNA表達水平:①預防組:與PDM組相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠腎臟Nephrin mRNA表達水平均顯著升高(P＜0.05)，VEGF mRNA表達水平均有顯著性下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性，中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組

15、相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組大鼠腎臟Nephrin mRNA表達水平均顯著升高(P＜0.05)，VEGF mRNA表達水平均有顯著性下降(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)改善最明顯(P＜0.05)，小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異(P＞0.05)。
　　9、采用Western Blotting技術檢測大鼠腎臟Nephrin、VEGF蛋白表達量:①預防組:與PDM組

16、相比，雷公藤多苷、小檗堿及雷公藤多苷聯合小檗堿預防組大鼠腎臟Nephrin蛋白表達量均顯著升高（P＜0.05），VEGF蛋白表達量均有顯著性下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性，中、高劑量組(PTM、PTH、PTBM、PTBH)改善最明顯(P＜0.05)。②治療組:與TDM組相比，雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿治療組大鼠腎臟Nephrin蛋白表達量均顯著升高(P＜0.05)，VEGF蛋白表達量均有顯著性下降（P＜0.05），且呈劑量依

17、賴性，中、高劑量組(TTM、TTH、TTBM、TTBH)改善最明顯（P＜0.05），小檗堿治療組(TB)與其無明顯差異（P＞0.05）。
　　結論
　　1、本實驗成功制備2型糖尿病和DN大鼠模型。
　　2、應用中劑量、高劑量雷公藤多苷及雷公藤多苷聯合小檗堿早期預防和治療DN，可顯著降低尿蛋白水平。
　　3、DN大鼠血清和腎臟中Nephrin的表達水平較正常對照組明顯下降，VEGF的表達水平較正常對照組明顯升高，提