雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿對(duì)糖尿病腎病大鼠腎小球基底膜相關(guān)因子的干預(yù)研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)特發(fā)性全身微血管病變的腎臟表現(xiàn)，是導(dǎo)致終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)的最主要原因。研究發(fā)現(xiàn)DN時(shí)腎小球基底膜的增厚是蛋白尿漏出的重要原因。本研究以高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)尾靜脈注射構(gòu)建的T2DM和DN大鼠動(dòng)物模型為研究

2、對(duì)象，以雷公藤多苷及小檗堿作為治療藥物，探討不同劑量雷公藤多苷及小檗堿對(duì)DN發(fā)生和發(fā)展的干預(yù)作用以及對(duì)腎小球基底膜可能存在的修復(fù)機(jī)制。
　　方法：
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠260只，隨機(jī)選取20只作為預(yù)防正常對(duì)照組(PNC)、治療正常對(duì)照組(TNC)，每組各10只，飼以常規(guī)飼料;其余240只飼以高糖高脂飼料8周后聯(lián)合小劑量STZ（30mg/kg）尾靜脈注射誘導(dǎo)成T2DM模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為預(yù)防組（P組）和治療組（T組

3、）:預(yù)防組和治療組均進(jìn)一步分為模型組(PDM、TDM)、雷公藤多苷低劑量干預(yù)組(PTL，1mg/kg·d、TTL，3mg/kg·d)、雷公藤多苷中劑量干預(yù)組（PTM，3mg/kg·d、TTM，6mg/kg·d）、雷公藤多苷高劑量干預(yù)組（PTH，6mg/kg·d、TTH，9mg/kg·d）、小檗堿干預(yù)組(PB、TB，均150mg/kg·d)、雷公藤多苷低劑量聯(lián)合小檗堿干預(yù)組(PTBL，1mg/kg·d+150mg/kg·d、TTBL，3m

4、g/kg·d+150mg/kg·d)、雷公藤多苷中劑量聯(lián)合小檗堿干預(yù)組（PTBM，3mg/kg·d+150mg/kg·d、TTBM，6mg/kg·d+150mg/kg·d）、雷公藤多苷高劑量聯(lián)合小檗堿干預(yù)組（PTBH，6mg/kg·d+150mg/kg·d、TTBH，9mg/kg·d+150mg/kg·d）。預(yù)防組于成模后開始灌胃，第8周末處死取材;治療組則于成模后第7周開始灌胃，第14周末處死取材。觀察大鼠成模、灌胃前后不同時(shí)間點(diǎn)各代

5、謝指標(biāo)的變化。光鏡、電鏡觀察大鼠腎臟腎小球形態(tài)、腎小球基底膜超微結(jié)構(gòu)的改變。采用ELISA方法檢測(cè)大鼠血清中Col-Ⅳ和LN水平的變化，采用RT-PCR和Western blotting方法分別從基因水平和蛋白水平觀察Col-Ⅳ和LN細(xì)胞因子在腎臟的表達(dá)情況并采用免疫組化方法對(duì)Col-Ⅳ和LN在腎臟中的表達(dá)進(jìn)行定位。
　　結(jié)果：
　　(1)高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，大鼠血TG、TC、FINS、HOMA-IR和HOMA-β指數(shù)高

6、于正常對(duì)照組(P＜0.05）。STZ注射后大鼠較正常對(duì)照組大鼠體重降低，血糖、腎重指數(shù)升高(P＜0.05），尿微量白蛋白水平自成模后第6周末升高(P＜0.05)，肝腎功能、血常規(guī)無明顯差異（P＞0.05）。
　　(2)24h尿UMA水平:①預(yù)防組:與PNC組相比，PDM和各預(yù)防組大鼠UMA明顯升高(P＜0.05)，雷公藤多苷、小檗堿、雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠UMA較PDM組呈劑量依賴性降低，即中、高劑量組降低最明顯（P＜0.

7、05）。②治療組:與TNC組相比，TDM和各治療組大鼠UMA明顯升高(P＜0.05)，雷公藤多苷治療組大鼠UMA較TDM組呈劑量依賴性降低(P＜0.05）;與TDM組相比，雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿治療組的UMA明顯降低，其中TTBM、TTBH劑量組降低最明顯(P＜0.05)。
　　(3)光鏡、電鏡病理結(jié)果:①預(yù)防組:PDM組大鼠可見腎小球輕度萎縮，系膜基質(zhì)輕度增多，腎小球毛細(xì)血管基底膜稍增厚以內(nèi)皮下附加性增厚為主，其內(nèi)、中、外三層微細(xì)

8、結(jié)構(gòu)消失、形態(tài)稍卷曲、電子密度均勻增高，毛細(xì)血管腔輕度變窄等類似于人類早期DN的腎臟病變，雷公藤多苷預(yù)防組有所改善，且中、高劑量組改善最明顯;加用小檗堿后，PTBM、PTBH組預(yù)防效果最明顯。②治療組:TDM組呈典型DN的腎臟病理改變，雷公藤多苷治療組中TTM、TTH組改善最明顯;聯(lián)合小檗堿治療后，TTBL組腎臟病理有所改善，以TTBM、TTBH組治療效果最明顯。
　　(4)ELISA法檢測(cè)大鼠血清Col-Ⅳ、LN水平:①血清Co

9、l-Ⅳ水平:模型對(duì)照組和預(yù)防、治療組大鼠血清Col-Ⅳ水平較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，與模型對(duì)照組相比，雷公藤多苷預(yù)防組、治療組大鼠血清Col-Ⅳ水平呈劑量依賴性降低(P＜0.05);聯(lián)合小檗堿后，預(yù)防組、治療組大鼠血清Col-Ⅳ水平較模型對(duì)照組呈劑量依賴性降低(P＜0.05)。②血清LN水平:模型對(duì)照組和各預(yù)防組、治療組大鼠血清LN水平較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)，與模型對(duì)照組相比，雷公藤多苷預(yù)防組、治療組大鼠血清L

10、N明顯降低(P＜0.05);聯(lián)用小檗堿后，PTBM、PTBH和各聯(lián)合治療組血清LN均明顯降低(P＜0.05)。
　　(5)RT-PCR法檢測(cè)大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN mRNA表達(dá):①預(yù)防組:PDM和各預(yù)防組大鼠腎臟Col-Ⅳ和LN mRNA表達(dá)較PNC組明顯升高(P＜0.05)，單用雷公藤多苷組、小檗堿組、雷公多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN mRNA表達(dá)較PDM組呈劑量依賴性降低（P＜0.05）。②治療組:TDM和各

11、治療組大鼠腎臟Col-Ⅳ和LN mRNA表達(dá)水平較TNC組明顯升高(P＜0.05)，單用雷公藤多苷治療組較TDM組呈劑量依賴性降低(P＜0.05);聯(lián)合小檗堿治療后，各治療組腎臟Col-Ⅳ、LN mRNA表達(dá)水平較TDM組呈劑量依賴性降低(P＜0.05)。
　　(6)Western Blotting法檢測(cè)大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN蛋白表達(dá):①預(yù)防組:PDM和預(yù)防組大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN蛋白表達(dá)較PNC組明顯升高（P＜0.05），雷

12、公藤多苷組、小檗堿組、雷公多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN蛋白表達(dá)較PDM組呈劑量依賴性降低(P＜0.05)。②治療組:TDM和治療組大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN蛋白表達(dá)較TNC組明顯升高(P＜0.05)，雷公藤多苷治療組較TDM組有不同程度降低，且中、高劑量組降低最明顯（P＜0.05）;聯(lián)合小檗堿治療后，各治療組大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN蛋白表達(dá)較TDM組呈劑量依賴性降低(P＜0.05)。
　　(7)免疫組化法染色觀察大鼠

13、腎臟Col-Ⅳ、LN蛋白表達(dá):Col-Ⅳ和LN主要在腎小球、腎小管基底膜、系膜區(qū)表達(dá)。①預(yù)防組:PDM組和各預(yù)防組大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN在腎小球基底膜、系膜區(qū)棕黃色顆粒浸潤(rùn)較PNC組明顯增多(P＜0.05)，單用雷公藤多苷組、小檗堿組、雷公多苷聯(lián)合小檗堿預(yù)防組大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN蛋白表達(dá)較PDM組有不同程度減少，且呈劑量依賴性(P＜0.05)。②治療組:TDM和各治療組大鼠腎臟Col-Ⅳ、LN在腎小球基底膜、系膜區(qū)棕黃色顆粒浸潤(rùn)較

14、TNC組明顯增多(P＜0.05);雷公藤多苷、雷公藤多苷聯(lián)合小檗堿治療組棕黃色顆粒浸潤(rùn)較TDM組呈劑量依賴性減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)成功制備2型糖尿病和糖尿病腎病動(dòng)物模型。
　　(2)DN大鼠血清中Col-Ⅳ、LN以及腎臟中Col-Ⅳ、LN的表達(dá)水平均較正常對(duì)照組明顯升高，提示腎小球基底膜中膠原和非膠原糖蛋白的積聚可能參與了DN的發(fā)生發(fā)展。
　　(3)中、高劑量雷公藤多苷、小檗堿或聯(lián)合應(yīng)用可