人老化髓核細(xì)胞的炎性因子表達(dá)變化分析.pdf

1、目的:
　　研究體外培養(yǎng)人類正常和退變腰椎間盤髓核細(xì)胞的基因表達(dá)譜，分析人老化髓核細(xì)胞的炎性因子表達(dá)變化。
　　方法:
　　1、體外傳代培養(yǎng)人正常髓核細(xì)胞系(Scien Ce114800)。連續(xù)性1∶3傳代、培養(yǎng)（理論上可傳至13代），誘導(dǎo)髓核細(xì)胞復(fù)制性老化。
　　2、取P8代髓核細(xì)胞按1×106個(gè)/孔接種于六孔板，按雙氧水濃度100μmol/L、作用時(shí)間2h/天、連續(xù)四天處理，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)髓核細(xì)胞過(guò)早老化。

2、r>　　3、分別對(duì)步驟1中每一代細(xì)胞及步驟2中的細(xì)胞老化前及應(yīng)激誘導(dǎo)老化后行顯微鏡下觀察髓核細(xì)胞的形態(tài)、SA-β-Gal染色并計(jì)數(shù)細(xì)胞老化率，制備兩組髓核細(xì)胞老化模型。（注:因目前尚無(wú)公認(rèn)的髓核細(xì)胞老化模型標(biāo)準(zhǔn)，本研究中擬定老化率≥80％、G1期細(xì)胞≥80％造模組為合格的髓核細(xì)胞老化模型。）
　　4、取P9代髓核細(xì)胞（老化陰性對(duì)照組）、復(fù)制性老化模型、應(yīng)激誘導(dǎo)的P9代過(guò)早老化模型3組細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)3組細(xì)胞TNF

3、-α及IL-1β、IL-6、IL-8等的相對(duì)表達(dá)含量。
　　結(jié)果:
　　1、在誘導(dǎo)髓核細(xì)胞復(fù)制性老化的過(guò)程中，隨著細(xì)胞傳代次數(shù)的增加，髓核細(xì)胞形態(tài)逐漸由類圓形、星形、短梭形向長(zhǎng)梭形、不規(guī)則形等形態(tài)轉(zhuǎn)變。細(xì)胞體積逐漸增大、胞質(zhì)變脆、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞老化率、流式細(xì)胞儀檢測(cè)G1期細(xì)胞比例均逐漸增加，傳至P13代時(shí)三者比例分別為81.1％、84.5％，差異與正常P9代髓核細(xì)胞相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

4、05)。
　　2、在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)髓核細(xì)胞過(guò)早老化的過(guò)程中，隨著雙氧水作用天數(shù)的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)逐漸由類圓形向長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞體積增加、胞漿空泡化明顯。SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)髓核細(xì)胞的老化率、流式細(xì)胞儀檢測(cè)G1期細(xì)胞比例均逐漸增大，且100μmol/L雙氧水作用P9代髓核細(xì)胞2h/天、連續(xù)四天后三者比例分別為80.3％、80.6％，差異與正常P9代髓核細(xì)胞相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在

5、復(fù)制性老化模型中，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)量較對(duì)照組均有所增加，差異較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在應(yīng)激誘導(dǎo)的過(guò)早老化模型中，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)量較對(duì)照組均有所增加，差異較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。復(fù)制老化模型組增幅與應(yīng)激老化模型組中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達(dá)量相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、通過(guò)連續(xù)性

6、傳代培養(yǎng)人正常髓核細(xì)胞系(Scien Cell4800)，成功建立髓核細(xì)胞復(fù)制性老化模型(P13代髓核細(xì)胞);
　　2、通過(guò)100μmol/L雙氧水作用于P9代髓核細(xì)胞2h/天，連續(xù)作用四天，成功建立應(yīng)激誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞過(guò)早老化模型;
　　3、在髓核細(xì)胞復(fù)制性老化與雙氧水誘導(dǎo)應(yīng)激老化模型中，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表達(dá)量均較正常P9代對(duì)照組明顯增高;
　　4、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8在