基于MAPK基因沉默和TMT標(biāo)記聯(lián)合LC-MS-MS技術(shù)研究雌二醇作用Ishikawa細(xì)胞的影響.pdf

1、第一部分慢病毒介導(dǎo)的MAPK基因沉默對(duì)雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa的影響
　　1、慢病毒shRNA載體構(gòu)建并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞株
　　[目的]本課題組前期發(fā)現(xiàn)雌二醇可以通過(guò)MAPK信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展，為明確MAPK信號(hào)通路對(duì)雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制，我們利用RNAi沉默子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa中的MAPK基因，并篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，為探究MAPK基因低表達(dá)對(duì)雌二

2、醇作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的影響奠定基礎(chǔ)。
　　[方法]
　　(1)設(shè)計(jì)合成4組特異性針對(duì)MAPK基因的siRNA，構(gòu)建shRNA質(zhì)粒載體，感染Ishikawa細(xì)胞。
　　(2)利用RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組對(duì)目的基因的抑制效果，篩選出沉默效果最佳的靶點(diǎn)。
　　(3)將選取的最佳靶點(diǎn)包裝成慢病毒shRNA載體，感染Ishikawa細(xì)胞。
　　(4)將感染目的基因的細(xì)胞Ishikawa，經(jīng)流

3、式分選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，采用RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組對(duì)目的基因的抑制效果。
　　[結(jié)果]
　　(1)RT-PCR和Western blot篩選出最佳干擾靶點(diǎn)，siRNA序列為:GGACTGTCTCTGGTAGAGATGGCGGTTGG
　　(2)測(cè)序證實(shí):運(yùn)用特異性針對(duì)MAPK基因的siRNA，成功構(gòu)建了慢病毒shRNA載體，包裝滴度為3×108 TU/ml。感染Ishikawa細(xì)胞后，熒光倒

4、置顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)，顯示各組感染效率均在90％以上，病毒感染成功。
　　(3)流式細(xì)胞儀分選后，RT-PCR和Western blot驗(yàn)證干擾效率，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。
　　[結(jié)論]RNA干擾技術(shù)可有效抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa中的MAPK基因表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　2、慢病毒介導(dǎo)的MAPK基因沉默對(duì)雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa的體外影響
　　[目的]利用RNA干擾技術(shù)抑制

5、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa中MAPK基因的表達(dá)，檢測(cè)MAPK基因低表達(dá)對(duì)雌二醇作用Ishikawa細(xì)胞后相關(guān)基因、蛋白的影響，及對(duì)細(xì)胞存活能力、周期、凋亡影響，探究MAPK基因低表達(dá)對(duì)雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa的影響及潛在機(jī)制。
　　[方法]課題組前期研究發(fā)現(xiàn):應(yīng)用10-6mol/L雌激素刺激細(xì)胞30min效果最佳。實(shí)驗(yàn)分四組:(1)Control組:無(wú)雌二醇刺激的Ishikawa細(xì)胞;(2)Ishikawa細(xì)胞

6、組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa細(xì)胞;(3)NC組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激轉(zhuǎn)染陰性慢病毒的Ishikawa細(xì)胞;(4)MAPK組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激前期構(gòu)建的MAPK-RNAi細(xì)胞。
　　(1)RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雌二醇作用四組細(xì)胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　(2)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)四組細(xì)胞生長(zhǎng)情況，分析MAPK基因沉默前后對(duì)Ishikawa

7、細(xì)胞生存率的影響。
　　(3)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell檢測(cè)四組細(xì)胞體外遷移能力，分析MAPK基因沉默前后對(duì)Ishikawa細(xì)胞體外遷移能力的影響。
　　(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)四組細(xì)胞周期及凋亡率變化，分析MAPK基因沉默前后對(duì)Ishikawa細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　[結(jié)果]
　　(1)Ishikawa組VEGF、bFGF基因及蛋白表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);NC組與Ishi

8、kawa組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05); MAPK組VEGF、bFGF基因及蛋白表達(dá)明顯減少，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(2)MTT結(jié)果顯示:Ishikawa組細(xì)胞倍增時(shí)間明顯加快，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);NC組與Ishikawa組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05); MAPK組細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。

9、　　(3)遷移結(jié)果顯示:Ishikawa組穿過(guò)微孔的細(xì)胞數(shù)明顯增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05); NC組與Ishikawa組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05); MAPK組穿過(guò)微孔的細(xì)胞數(shù)明顯減少，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(4)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:Ishikawa組細(xì)胞總凋亡率(％)明顯下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);NC組與Ishikawa組相比差異無(wú)統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義(p＞0.05); MAPK組細(xì)胞中晚期凋亡率、總凋亡率(％)均明顯增加，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(5)細(xì)胞周期結(jié)果顯示:Ishikawa組細(xì)胞G0/G1期比率明顯下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05); NC組與Ishikawa組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05); MAPK組細(xì)胞G0/G1期明顯增加，S期和G2期減少，與shikawa組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.0

11、5)。
　　[結(jié)論]MAPK基因低表達(dá)可以干擾E2在基因及蛋白水平激活子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞產(chǎn)生VEGF、bFGF，可以下調(diào)E2對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用和凋亡的抑制作用。
　　3、構(gòu)建MAPK基因低表達(dá)Ishikawa細(xì)胞裸鼠移植瘤模型
　　[目的]構(gòu)建MAPK基因低表達(dá)Ishikawa細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，觀察MAPK基因低表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響，探究MAPK基因能否成為子宮內(nèi)膜癌基因治療的分子靶點(diǎn)。

12、>　　[方法]將BALB/C裸鼠隨機(jī)分為3組，每組6只。實(shí)驗(yàn)分組:(1) Ishikawa組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa細(xì)胞;(2)NC組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激轉(zhuǎn)染陰性慢病毒的Ishikawa細(xì)胞;(3) MAPK組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激的MAPK-RNAi細(xì)胞。
　　將細(xì)胞分別接種于裸鼠右側(cè)背部。觀察移植瘤成瘤情況及腫瘤生長(zhǎng)情況，成瘤后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)。按照腫

13、瘤體積計(jì)算公式:V=0.5×a×b2來(lái)計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。應(yīng)用WesternBlot檢測(cè)各組MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　[結(jié)果]成功構(gòu)建子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型。MAPK組裸鼠移植瘤增長(zhǎng)速度明顯減慢、瘤體重量減少、蛋白MAPK、VEGF、bFGF的表達(dá)明顯降低，與Ishikawa組、NC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);而Ishikawa組移植瘤增長(zhǎng)速度、瘤體重量、蛋白MAPK、VEGF、bFGF的表

14、達(dá)，與NC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　[結(jié)論]MAPK基因低表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，提示MAPK基因有可能成為子宮內(nèi)膜癌基因治療的分子靶點(diǎn)。
　　第二部分基于TMT標(biāo)記聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)篩選雌激素作用Ishikawa細(xì)胞后的差異蛋白研究
　　[目的]使用TMT定量蛋白組學(xué)技術(shù)研究雌激素作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，尋找與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的診斷標(biāo)志物及探索子宮內(nèi)膜

15、癌的發(fā)病機(jī)制。
　　[方法]實(shí)驗(yàn)分2組:(1))Control組:無(wú)雌二醇刺激的Ishikawa細(xì)胞;(2)雌激素組:經(jīng)10-6mol/L雌二醇刺激的Ishikawa細(xì)胞。
　　本實(shí)驗(yàn)利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，采用基于TMT的蛋白組學(xué)技術(shù)分析不同分組的Ishikawa細(xì)胞差異蛋白，選取差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行液相色譜儀聯(lián)合質(zhì)譜分析，借助生物信息學(xué)方法篩選出有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)，Mascot軟件搜索Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定

16、差異蛋白質(zhì)，采用In Cell ELISA技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)的規(guī)律。
　　[結(jié)果]
　　(1)經(jīng)TMT定量蛋白組學(xué)分析，共篩選出92個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)蛋白80個(gè)，下調(diào)蛋白12個(gè);
　　(2)差異蛋白的亞細(xì)胞定位主要集中在細(xì)胞核上;
　　(3)差異蛋白主要參與10條代謝通路代謝通路，主要是mTOR信號(hào)通路（參與蛋白:RPS6KA1）、RNA transport通路（參與蛋白:NCBP1;RPP30;EIF3B;Pin

17、in;ACIN1)及mRNA surveillance pathway通路(參與蛋白:NCBP1; Pinin; ACIN1);
　　(4)使用生物信息學(xué)方法對(duì)這92個(gè)差異蛋白進(jìn)行全面分析，并采用InCell ELISA技術(shù)對(duì)差異蛋白R(shí)PS6KA1進(jìn)行驗(yàn)證，表達(dá)趨勢(shì)與質(zhì)譜一致。
　　[結(jié)論]
　　(1)本研究證明基于TMT標(biāo)記聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)可作為鑒定篩選子宮內(nèi)膜癌差異蛋白的有效方法;
　　(2)雌激素組