以臍帶間充質(zhì)干細胞重層化培養(yǎng)成膠構(gòu)建組織工程軟組織填充材料的實驗研究.pdf

1、目的：
　　1.研究重層化培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)過程中細胞因子的分泌情況及其形成的膠體的材料特性；2.將重層化人臍帶間充質(zhì)干細胞形成的膠體，通過小鼠體內(nèi)移植實驗，探究其作為一種軟組織填充材料的可行性。
　　方法：
　　1.從我院健康孕婦的剖宮產(chǎn)術(shù)中獲取臍帶，并通過組織塊貼壁法培養(yǎng)出原代HUCMSCs。繼續(xù)傳代、擴增培養(yǎng)得到第三代HUCMSCs，待之達到100％融合時，加入抗壞血酸1ul/ml培養(yǎng)基，加入的抗壞血酸的

2、濃度為50ug/ml，每2天換液，連續(xù)培養(yǎng)至14天，細胞培養(yǎng)50%、100%融合，重層化培養(yǎng)的第1、3、7、14天留取上清樣本，至14天肉眼觀察細胞形成膜狀，即得到重層化的HUCMSCs膠體，用ELISA測定收集的上清，重層化培養(yǎng)過程的生長因子變化情況，用組織化學(xué)法了解其膠體的材料構(gòu)成。
　　2.取7周齡的昆明小鼠24只，分成3組，將實驗的填充材料注射到小鼠背部肌膜下，制作動物軟組織填充實驗?zāi)Ｐ停恐粍游镒笥覂蓚?cè)各取兩個注射點，左

3、側(cè)兩個作為實驗組，右側(cè)相同位置作為實驗組。實驗組為AJ組（ASC成膠組）：含有0.5ml的重層化HUCMSCs膠體與0.5ml的DMED；對照組1為PJ組（ppp成膠組）：含有0.5ml的PPP+細胞膠體與0.5ml的DMEM；對照組2為H組（HUMCSs）：含有2.5×106的HUMSCs與1ml的DMEM。分別在注射后的第15、28天對注射區(qū)皮膚進行大體觀察，并計算填充物占初始大小的百分比，注射區(qū)皮膚組織切片HE染色觀察，.通過免疫

4、熒光染色法觀察 I型膠原和血管的生成情況。
　　結(jié)果：
　　重層化培養(yǎng)的HUCMSCs在培養(yǎng)過程中可分泌高水平的IGF-I、HGF、TGF-β1、VEGF等各種細胞因子，自我合成Ⅰ、Ⅲ型膠原及透明質(zhì)酸等形成細胞外基質(zhì)，并轉(zhuǎn)變?yōu)棣?SMA陽性表達，培養(yǎng)至14天可形成穩(wěn)定的膠體膜片。動物實驗表明，14天后AJ組剩余的填充物體積占原始大小的36.14±2.67%，PJ組為8.426±0.66%，H組為0.73±0.13%，28后A