高遷移率族蛋白B1抑制劑防治肝纖維化的實驗研究.pdf

1、高遷移率族蛋白B1(High mobility group box1 protein,HMGB1)是30年前發(fā)現(xiàn)的一種核內(nèi)非組蛋白。以往的研究主要集中于它在細胞核內(nèi)的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)HMGB1可在LPS、IL-1、TNF-α等刺激下由單核/巨噬細胞釋放,也可通過各種組織的壞死細胞漏逸到細胞外,釋放到細胞外的HMGB1可與RAGE、TLR4等多種受體結(jié)合,發(fā)揮相應的生物學作用。而各種原因?qū)е赂闻K炎癥或壞死均可使HMGB1釋放到細胞外,

2、活化TLR4等受體,而TLR4通路被證實是肝臟纖維化形成機制的關(guān)鍵節(jié)點?；谝陨侠碚?考慮HMGB1在肝臟纖維化形成機制中也可能扮演重要角色。
　　 目的:本研究首先通過選擇白求恩國際和平醫(yī)院及石家莊市第五醫(yī)院行肝穿刺患者作為研究對象,檢測不同程度肝纖維化患者血清HMGB1水平,探討肝纖維化程度和HMGB1水平之間的關(guān)系,并進一步通過構(gòu)建小鼠四氯化碳肝纖維化模型來驗證HMGB1在肝纖維化形成中的作用,以及探討采用HMGB1抑制劑

3、正丁酸鈉阻止HMGB1合成或釋放是否可延緩肝纖維化進展,希望為臨床阻止肝纖維化進展提供新的策略和途徑。
　　 方法:
　　 1 臨床病例的搜集:隨機選擇2008年12月至2010年6月年齡為18～58歲不同程度慢性乙型病毒性肝炎及肝硬化患者73例,診斷標準符合2005年中華醫(yī)學會感染病分會、中華醫(yī)學會肝病學分會和中國肝炎防治基金會聯(lián)合頒布的《慢性乙肝防治指南》,排除其它肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝炎

4、、腫瘤等疾病后作為入組病例,其中男性54例、女性19例,平均年齡34.6±10.35歲,G1-G2組43例、G3-G4組30例、S1-S2組34例、S3-S4組39例,同時選擇12名健康人作為對照,其中男性5例、女性7例,平均年齡33.1±9.6歲,空腹抽血進行肝功能、血清HMGB1水平檢測,患者在超聲引導行肝臟活組織病理檢查,了解肝纖維化程度,綜合上述數(shù)據(jù)分析,明確HMGB1水平與肝纖維化程度的關(guān)系,了解HMGB1在肝纖維化形成中的作

5、用。
　　 2 HMGB1抑制劑防治肝纖維化的實驗研究:清潔級雄性BALB/C小鼠50只,體重18～24 g,隨機分為正丁酸鈉預防組20只,給予40％CCL4(橄欖油稀釋),2 mL/kg,每周二、五行腹腔注射,同時給予1.5％正丁酸鈉喂水共70天,模型組20只僅給予40％CCL4(橄欖油稀釋)腹腔注射,2 mL/kg,每周二、五行腹腔注射,正常對照組10只每周二、五給予0.9％生理鹽水2 mL/Kg行腹腔注射,三組均在用藥后7

6、0天處死,留取血清備用,通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術(shù)檢測HMGB1水平、肝功能,部分肝組織固定于4％多聚甲醛中,用于免疫組化檢查,明確肝臟在受到損傷后,HMGB1的移位情況,部分肝組織凍存于-80度冰箱中,用于Western blot檢測,了解HMGB1的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1 慢性肝病患者HMGB1水平與炎癥活動度的關(guān)系:健康對照組HMGB1水平為16.86±3.48 ng/mL,G1-G2組為26.

7、54±5.31 ng/mL,G3-G4組為33.64±8.35 ng/mL。慢性肝病患者HMGB1水平較健康對照組明顯升高,三組組間比較均有顯著性差異(P＜0.01),G3-G4組明顯高于G1-G2組(P＜0.01)。
　　 2 慢性肝病患者HMGB1水平與纖維化程度的關(guān)系:健康對照組HMGB1水平為16.86±3.48 ng/mL,S1-S2組為28.83±7.53 ng/mL、S3-S4組為30.0±7.61 ng/mL,健

8、康對照組與S1-S2組、S3-S4組均有顯著差異(P＜0.01)。S1-S2組與S3-S4組比較無顯著差異(P＞0.05)。
　　 3 慢性肝病患者HMGB1水平與肝功能的關(guān)系:血清HMGB1水平與ALT(r=0.2566,P＜0.05)、AST(r=0.4719,P＜0.01)均呈顯著正相關(guān),與ALB(r=0.114,P＞0.05)、TBIL(r=0.141,P＞0.05)無明顯相關(guān)。
　　 4 正丁酸鈉干預對小鼠血清

9、HMGB1水平的影響:采用CCl4造模成功后檢測血清HMGB1水平較對照組明顯升高,全程給予正丁酸鈉干預可顯著降低血清HMGB1水平,其中模型組為30.75±7.43 ng/mL,干預組為25.54±3.97 ng/mL,組間比較具有顯著差異(P＜0.01)。
　　 5 正丁酸鈉干預對炎癥活動分級及纖維化程度的影響:給予CCl4造模70天處死小鼠,模型組炎癥活動度G1-G2級4只,G3-G4級10只,干預組G1-G2級13只,G

10、3-G4級6只,組間比較具有顯著性差異(x2=5.125,P＜0.05)。模型組纖維化程度S1-S2期3只,S3-S4期11只,而干預組S1-S2期12只,S3-S4期7只,組間比較差異明顯(x2=5.661,P＜0.05)。
　　 6 小鼠肝組織病理HE及天狼猩紅染色:在模型組可見正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,肝細胞索排列紊亂,肝細胞大量壞死,可見假小葉形成;干預組肝小葉結(jié)構(gòu)大部分被保留,可見纖維間隔形成,但未見典型假小葉形成。

11、>　　 7 小鼠肝組織免疫組化:對照組肝組織內(nèi)HMGB1主要表達于有核細胞核內(nèi),胞質(zhì)內(nèi)有少量表達,細胞間組織未見表達。模型組不僅在胞內(nèi)可見HMGB1的表達,在組織間隙可見廣泛分布的片狀染色,且多位于炎癥較重或存在組織壞死的區(qū)域。與模型組相比,干預組組織間HMGB1的表達水平明顯降低。
　　 8 小鼠肝組織Western blot結(jié)果:與正常對照相比,模型組肝組織HMGB1表達水平顯著升高,而在干預組HMGB1表達水平較模型組顯

12、著下降。
　　 9 正丁酸鈉干預對小鼠死亡率的影響:在70天造模過程中,模型組有6只小鼠死亡,死亡率為30％,而干預組僅有1只小鼠死亡,死亡率為5％,具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1 肝纖維化患者血清HMGB1水平較健康對照明顯升高,且與肝組織炎癥活動度密切相關(guān),可能是啟動肝臟炎癥后纖維化進程的重要原因。
　　 2 小鼠CCL4肝纖維化模型肝內(nèi)和血清中HMGB1水平均顯著上升,且與