Islet-1促MSCs向心肌樣細胞分化中甲基化-乙?；换プ饔脵C制研究.pdf

1、目的：
　　明確在 Islet-1誘導的間充質干細胞（Mesenchymal stem cells， MSCs）向心肌樣細胞分化過程中組蛋白甲基化/乙?；虳NA甲基化修飾在調控心肌早期轉錄因子表達中的作用，鑒定出三種修飾參與調控這些因子的關鍵酶，并初步探明這些關鍵酶在調控心肌早期轉錄因子過程中交互作用的機制。為提高 MSCs向心肌細胞的分化率以更好地應用于臨床治療心血管疾病打下重要的實驗基礎。
　　方法：
　　1.染

2、色質免疫共沉淀（ Chromatin immunoprecipitation qPCR， ChIP-qPCR）檢測轉染GATA4和Nkx2.5啟動子區(qū)組蛋白乙酰化/甲基化水平，以及三種修飾的關鍵酶與這些區(qū)域的結合情況
　　2.甲基化特異性PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）用以初步檢測GATA4和Nkx2.5啟動子區(qū)的DNA甲基化水平
　　3.亞硫酸鹽測序（bisulfite sequencin

3、g PCR，BSP）對MSP中DNA甲基化水平變化明顯的樣本進行驗證
　　4.熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）檢測GATA4和Nkx2.5的mRNA表達水平
　　5. Western blot檢測組蛋白甲基化/乙?；虳NA甲基化修飾各自發(fā)揮作用的關鍵酶表達情況、
　　6.免疫熒光檢測心肌特異蛋白 cTnT和縫隙連接蛋白 Cx43的表達，以驗證MSCs是否向心肌

4、樣細胞分化
　　結果：
　　1.在Islet-1誘導的分化過程中，GATA4啟動子區(qū)第二位點組蛋白乙酰化水平逐漸升高，而組蛋白甲基化和DNA甲基化水平逐漸降低；Nkx2.5啟動子區(qū)組蛋白乙酰化/甲基化水平與其在GATA4啟動子區(qū)的趨勢一致，但DNA甲基化水平在整個分化過程中沒有改變
　　2. Islet-1誘導同時用5-aza改變DNA甲基化水平，可以引起GATA4啟動子區(qū)第二位點組蛋白乙?；吆徒M蛋白甲基化水平降低

5、，但是無法改變Nkx2.5啟動子區(qū)的組蛋白乙?；?甲基化水平
　　3. Islet-1誘導同時用TSA改變組蛋白乙酰化水平，GATA4啟動子區(qū)第二位點的組蛋白甲基化水平和 DNA甲基化水平都明顯降低，而Nkx2.5啟動子區(qū)僅表現(xiàn)出組蛋白甲基化水平降低
　　4. Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Islet-1誘導分化過程中三種表觀遺傳修飾的關鍵酶有明顯變化的有 Gcn5、P300、HDAC1、G9A、DNMT-1和DNMT-3

6、a
　　5. ChIP-qPCR檢測出與GATA4和Nkx2.5啟動子區(qū)結合的關鍵酶主要有Gcn5、HDAC1、G9A、DNMT-1，另外HP1-α和HP1-β也結合在這些區(qū)域；DNMT-1、HP1-α和HP1-β雖然與Nkx2.5有結合，但在整個分化過程中結合水平并沒有變化
　　6.與Islet-1誘導組相比抑制Gcn5后GATA4和Nkx2.5的表達水平明顯降低，且沒有出現(xiàn)cTnT和Cx43的表達，表明抑制Gcn5能夠阻

7、止MSCs向心肌樣細胞分化
　　7.抑制Gcn5后，與Islet-1誘導組相比HDAC1、G9A、HP1-α、HP1-β和DNMT-1與GATA4啟動子區(qū)的結合都明顯升高，且該區(qū)域的組蛋白乙酰化水平顯著降低，組蛋白甲基化和DNA甲基化水平明顯升高；而HP1-α、HP1-β和DNMT-1與Nkx2.5的結合沒有受到Gcn5被抑制的影響，因而DNA甲基化水平與Islet-1誘導組相比沒有明顯改變
　　結論：
　　Islet