Jak2調(diào)控Th1-Treg細(xì)胞平衡對心臟移植排斥反應(yīng)的防治及機制研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　對于那些患有嚴(yán)重心臟疾病的病人來講，心臟移植手術(shù)是目前唯一能挽救他們生命并且提高其生活質(zhì)量的治療手段。但是和眾多器官移植手術(shù)類似，心臟移植術(shù)后的排斥反應(yīng)是影響移植心臟發(fā)揮正常功能及病人長期存活的最大障礙。雖然免疫抑制劑的使用大大提高了心臟移植術(shù)后病人的生存率，但是不能忽視的是免疫抑制劑對機體存在毒副作用并會引起嚴(yán)重并發(fā)癥。近來，以調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells, Treg）為基礎(chǔ)的細(xì)胞治

2、療方法因其能明顯減少移植物術(shù)后慢性排斥反應(yīng)且?guī)缀鯚o任何毒副作用而越來越受到科研界的追捧。然而，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的治療方案也存在著一些急需解決的問題，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在體外較難擴增，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞存在不穩(wěn)定性以及抗原特異性等，這些都影響了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，更好的了解調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機制以及探究影響調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞生存發(fā)育的重要因素對于其在臨床上的安全應(yīng)用及推廣至關(guān)重要。
　　作為非受體酪氨酸蛋白激酶，哺乳動物Jak激酶家族包

3、括四個進(jìn)化保守的成員：Jak1，Jak2，Jak3和Tyk2。Jak/STAT作為細(xì)胞因子的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)的產(chǎn)生過程中都發(fā)揮關(guān)鍵的作用。當(dāng)細(xì)胞因子與相關(guān)細(xì)胞表面受體結(jié)合后會活化Jak激酶家族，導(dǎo)致Jak激酶在酪氨酸殘基上發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而產(chǎn)生錨定位點致使信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT）發(fā)生磷酸化。經(jīng)Jak激活的磷酸化STAT成員接下來會組成同源二聚體或者異源二聚體，這些二聚體會發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答基因

4、的表達(dá)。值得注意的是，最近有研究表明針對 Jak3的特異性抑制劑可以作為免疫抑制劑，用于治療移植免疫排斥反應(yīng)和自身免疫性相關(guān)疾病。然而由于IL-2-Jak3-STAT5信號通路對于Treg細(xì)胞至關(guān)重要，因此當(dāng)Jak3被抑制后會導(dǎo)致對移植物有保護(hù)作用的Treg細(xì)胞同時被抑制，這也是限制此種治療方法廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療臨床上移植物急慢性排斥反應(yīng)的主要原因。
　　Jak激酶家族另外一個重要成員，Jak2激酶參與調(diào)控了許多生命活動，例如：

5、細(xì)胞的增殖，活化以及分化等。與Jak3激酶不同的是，現(xiàn)在對Jak2激酶功能的研究主要集中在 V617F功能獲得性突變與惡性血液病的相關(guān)性研究。體外實驗表明，Jak2對于 IL-3，IL-5，IL-12，IFN-γ以及單核巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等信號通路至關(guān)重要。種種跡象表明 Jak2可能參與體內(nèi)的免疫應(yīng)答,因此我們從美國Kay-Uwe Wagner教授實驗室引進(jìn)了一種條件誘導(dǎo)性敲除Jak2基因的小鼠品系，以此來研究 Jak

6、2激酶在免疫細(xì)胞中的作用。本實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn)，在固有免疫應(yīng)答中，成年小鼠條件性敲除Jak2基因后，會導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞（DC）的發(fā)育和成熟障礙。但是，Jak2激酶缺失對適應(yīng)性免疫應(yīng)答的影響，尤其是對輔助性T細(xì)胞各亞群的影響，我們還是不甚了解。因此，在本實驗中我們用成年誘導(dǎo)性Jak2基因敲除的SPF級小鼠，運用小鼠異系異位心臟移植模型探討 Jak2激酶在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用及其機制。在實驗中，發(fā)現(xiàn) Jak2基因缺失對于同種異系心臟移植后

7、的排斥反應(yīng)有免疫保護(hù)作用，其機制主要是通過抑制具有促炎作用的Th1細(xì)胞亞群以及相對增加具有免疫調(diào)節(jié)作用的Treg細(xì)胞亞群來實現(xiàn)。
　　二、實驗方法和結(jié)果：
　　首先給8周齡Cre+/+-Jak2fl/fl小鼠連續(xù)5天腹腔注射特莫西芬，誘導(dǎo)其特異性敲除Jak2基因。分析Jak2缺失小鼠發(fā)現(xiàn)，相對于對照組小鼠來說，Jak2基因缺失小鼠表現(xiàn)出明顯的脾臟細(xì)胞數(shù)量減少的現(xiàn)象。更有趣的是，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Jak2基因缺失小鼠脾

8、臟細(xì)胞中，幾乎沒有髓系來源的細(xì)胞，這和我們之前研究發(fā)現(xiàn) Jak2基因缺失導(dǎo)致DC細(xì)胞生存發(fā)育障礙的結(jié)論一致,與此相反的是淋巴系來源的細(xì)胞比例明顯增多。和這一現(xiàn)象一致的是，CD4陽性T細(xì)胞在脾臟總細(xì)胞中所占的比例相對于對照組來說增加了一倍。我們同時發(fā)現(xiàn) Jak2基因缺失小鼠的外周血中淋巴系細(xì)胞和CD4陽性T細(xì)胞比例也明顯增高。
　　由于Jak2基因缺失會影響淋巴系來源細(xì)胞，那么接下來我們開始探討Jak2是具體影響到哪些T細(xì)胞亞型。我

9、們分別提取Jak2基因缺失和野生型小鼠脾臟細(xì)胞，通過流式抗體標(biāo)記CD3，CD4和CD8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CD3陽性T細(xì)胞中，Jak2基因缺失并沒有改變CD4和CD8陽性T細(xì)胞的比例，以上結(jié)果在淋巴結(jié)和外周血中也得了到證實。然而有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在Jak2基因缺失小鼠體內(nèi)，CD4+CD44high CD62Llow效應(yīng)或記憶性T細(xì)胞（TEM細(xì)胞）比例明顯降低，同時分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞比例也明顯減少。與此相反的是，CD4+Foxp3+Tre

10、g細(xì)胞的比例在Jak2基因缺失后明顯升高。
　　接下來我們使用na?ve T細(xì)胞試劑盒分別從Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠的脾臟中分選出CD4+CD44lowCD62Lhigh naive T細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞分別在Th1和Treg細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，最后用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測IFN-γ陽性T細(xì)胞和foxp3陽性T細(xì)胞來確定Jak2激酶缺失是否會對na?ve T細(xì)胞的定向分化產(chǎn)生影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠來源的na?ve T細(xì)胞

11、能夠很好的分化為分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞，而Jak2基因缺失小鼠來源的na?ve T細(xì)胞幾乎不能分化為Th1細(xì)胞。為了進(jìn)一步確認(rèn)以上分化結(jié)果，我們在Th1細(xì)胞定向分化培養(yǎng)環(huán)境中又額外的加入了細(xì)胞因子IFN-γ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IFN-γ能夠進(jìn)一步提高WT小鼠來源的na?ve T細(xì)胞的定向分化能力，但是細(xì)胞因子IFN-γ并沒有逆轉(zhuǎn)由于Jak2基因缺失而導(dǎo)致的na?ve T細(xì)胞不能分化為Th1細(xì)胞的現(xiàn)象。有趣的是，與野生型小鼠相比，Jak

12、2基因缺失后不但沒有影響na?ve T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞，反而促進(jìn)了此過程。尤其是在Treg細(xì)胞定向分化培養(yǎng)環(huán)境中加入了抗CD28抗體刺激后，Jak2基因缺失小鼠來源的naive T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞的能力進(jìn)一步提高。
　　根據(jù)以上結(jié)果發(fā)現(xiàn), Jak2基因缺失后一方面抑制了Th1細(xì)胞的發(fā)育,另一方面又促進(jìn)了Treg細(xì)胞的分化發(fā)育，這讓我們聯(lián)想到Jak2激酶是否會參與同種異體移植物排斥反應(yīng)，因為這種排斥反應(yīng)主要是由CD4陽性

13、T細(xì)胞介導(dǎo)。為了證明這個假設(shè)，我們運用小鼠異系異位心臟移植模型，即將BABL/c(H-2d)來源的小鼠心臟移植到與其有不同遺傳背景(H-2b)的Jak2基因缺失小鼠或?qū)φ找吧虲57BL/6J(H-2b)小鼠的腹部。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)，Jak2基因敲除后相對于野生對照組來說能夠明顯延長心臟移植物的存活時間（平均生存期為58±30.6天 vs.7±0.3天, p<0.001）。
　　接下來我們對小鼠移植后的心臟做了病理學(xué)檢查，由此來確定以

14、上實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們在心臟移植術(shù)后第6天取出心臟移植物，經(jīng)過固定包埋后，做成病理切片，然后通過HE染色觀察到對照野生型小鼠的移植心臟中有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，而且心肌細(xì)胞也大量的被破壞。與此相反的是，Jak2基因缺失小鼠的移植心臟中幾乎看不到炎癥細(xì)胞浸潤，而且心肌細(xì)胞完好無損。隨后將移植6天后的心臟組織提取RNA，通過real-time PCR技術(shù)檢測兩組移植心臟中的炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子的差別。我們發(fā)現(xiàn)在對照野生型組移植心臟中高表

15、達(dá) IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-6, IL-12p40和CCL-2等，而在Jak2基因缺失小鼠移植心臟中上述炎癥因子含量很低，尤其是IFN-γ和 IL-12p40幾乎檢測不到。
　　之前的實驗結(jié)果表明Jak2激酶會影響小鼠體內(nèi)輔助性T細(xì)胞亞群的構(gòu)成比，因此接下來我們想比較一下心臟移植術(shù)后的Jak2基因缺失心臟移植受體小鼠和野生型心臟移植受體小鼠體內(nèi)輔助性T細(xì)胞亞群的比例差異。首先取出移植術(shù)后6天各組小鼠的脾臟，通

16、過流式細(xì)胞術(shù)我們發(fā)現(xiàn)在脾臟細(xì)胞中，Jak2基因缺失受體小鼠產(chǎn)IFN-γ的Th1細(xì)胞亞群比例明顯低于野生型受體小鼠，于此相反的是Treg細(xì)胞亞群比例高于野生型受體小鼠。在心臟移植物引流淋巴結(jié)中也得到了相同的結(jié)果。
　　眾所周知，Treg細(xì)胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，因此我們想探討 Jak2基因缺失是否會影響到Treg細(xì)胞的功能。首先用Treg細(xì)胞分選試劑盒從Jak2基因缺失和野生型心臟移植受鼠脾臟中分選出CD4+CD25+Tre

17、g細(xì)胞，然后從正常野生型小鼠脾臟中分選出CD4陽性效應(yīng)T細(xì)胞。接下來用CFSE標(biāo)記被抗CD3抗體刺激活化的CD4陽性效應(yīng)T細(xì)胞，然后將其分別以不同比例與Jak2基因缺失小鼠或野生型小鼠來源的CD4+CD25+Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)Jak2基因敲除的Treg細(xì)胞其免疫抑制能力與WT小鼠來源的Treg細(xì)胞相當(dāng)，這說明Jak2激酶并不影響Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。
　　Jak2基因缺失是否會影響到CD4陽性T細(xì)胞的增殖能力呢?為了

18、闡明這個問題，我們分別從Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠脾臟中分選出CD4陽性T細(xì)胞，然后用CFSE標(biāo)記這些細(xì)胞，接下來用抗CD3抗體+抗CD28抗體或PMA+離子霉素刺激這些CD4陽性T細(xì)胞。和我們預(yù)想的一樣，經(jīng)過刺激后Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠脾臟來源的CD4陽性T細(xì)胞表現(xiàn)出類似的增殖能力，這說明Jak2激酶并不參與CD4陽性T細(xì)胞的增殖過程。為了確認(rèn)以上結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們用混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實驗來評估同種異系抗原刺激的增殖過

19、程。首先體外培養(yǎng)準(zhǔn)備BALB/c小鼠骨髓來源的DC細(xì)胞（bone marrow-derived DC），然后用絲裂霉素C處理DC細(xì)胞讓它們不能分裂增殖，接下來用這些DC細(xì)胞在體外培養(yǎng)刺激Jak2基因缺失小鼠或野生型小鼠脾臟來源的CD4陽性T細(xì)胞。和之前體外刺激實驗一致，Jak2基因缺失的CD4陽性T細(xì)胞經(jīng)過同種異系抗原刺激后其增值能力與野生型小鼠來源的CD4陽性T細(xì)胞相當(dāng)。
　　為了探討Jak2基因缺失是通過哪條信號通路影響Th1

20、細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間的動態(tài)平衡，我們首先在CD4陽性T細(xì)胞中檢測各種細(xì)胞因子導(dǎo)致的Jak2激酶活性的改變。我們從野生型小鼠脾臟中分選出CD4陽性T細(xì)胞，然后分別用IFN-γ, IL-12和IL-2去刺激細(xì)胞，然后用western blot方法檢測p-Jak2激酶蛋白水平的變化。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過IFN-γ或IL-12刺激后，p-Jak2激酶明顯增多，而IL-2刺激后的CD4陽性T細(xì)胞中的p-Jak2激酶幾乎檢測不到。
　　以上結(jié)果提

21、示我們?nèi)z測經(jīng)過IFN-γ或IL-12刺激后，Jak2激酶下游到底是哪些信號分子發(fā)生了改變。我們發(fā)現(xiàn)，在靜息狀態(tài)下，野生型和 Jak2基因缺失小鼠來源的CD4陽性T細(xì)胞中p-STAT4幾乎檢測不到，但是經(jīng)過IL-12刺激后，野生型小鼠來源的CD4陽性T細(xì)胞中p-STAT4明顯提高，而Jak2基因缺失小鼠來源的CD4陽性T細(xì)胞中p-STAT4依舊檢測不到。與此類似的是，細(xì)胞因子IFN-γ能誘導(dǎo)野生型來源CD4陽性T細(xì)胞高表達(dá)p-STAT1

22、，而雖然經(jīng)過IFN-γ刺激，Jak2基因缺失小鼠來源的CD4陽性T細(xì)胞中p-STAT1仍然幾乎檢測不到。有趣的是，經(jīng)過細(xì)胞因子IL-2刺激后，Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠來源的CD4陽性 T細(xì)胞都能誘導(dǎo)高表達(dá)p-STAT5,并且兩組之間差別不大。綜合以上結(jié)果我們得知，Jak2激酶缺失后能夠選擇性的抑制IL-12/STAT4和IFN-γ/STAT1信號通路，進(jìn)而減弱了na?ve T細(xì)胞定向分化為Th1細(xì)胞的能力。與此相反的是，Jak2

23、激酶對于IL-2/STAT5信號通路來說是非必要的，所以Jak2激酶缺失后并不影響到 Treg細(xì)胞的發(fā)育。由于Jak2激酶缺失并不影響IL-2/STAT5信號通路，那么Jak2基因缺失小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞比例升高的原因可能是由于IL-12和IFN-γ信號通路受損，導(dǎo)致在體內(nèi)缺失了IFN-γ的環(huán)境中，Jak2基因缺失小鼠來源的na?ve T細(xì)胞更傾向于分化為Treg細(xì)胞。
　　為了弄清楚Jak2基因缺失到底是通過哪些更深層的機制來影

24、響Th1細(xì)胞亞群的發(fā)育，我們需要檢測Jak2基因缺失后對于Th1細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響，例如T-bet蛋白（轉(zhuǎn)錄因子T box21）和Hlx(H2.0-like homeobox),其中T-bet作為Th1的主調(diào)控因子參與Th1的分化，而Hlx能夠誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，進(jìn)而維持Th1細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。首先，我們用na?ve T細(xì)胞試劑盒分別從Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠脾臟中分選出na?ve T細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞放在Th1細(xì)胞定

25、向分化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，最后用western blotting方法檢測以上兩個Th1細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)來自于野生型小鼠的na?ve T細(xì)胞經(jīng)過定向分化后，細(xì)胞蛋白中T-bet和Hlx蛋白表達(dá)明顯增多。與此相反的是，Jak2基因缺失的na?ve T細(xì)胞經(jīng)過定向分化以后，細(xì)胞中T-bet和Hlx蛋白幾乎檢測不到。為了進(jìn)一步確認(rèn)以上結(jié)果，我們又檢測了Runx3（Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3）的表達(dá)，Runx3主要是和T-bet協(xié)

26、同作用來保證Th1細(xì)胞的分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Runx3蛋白表達(dá)和T-bet一樣，在野生型小鼠來源的分化細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，而在 Jak2基因缺失小鼠來源的分化細(xì)胞中幾乎檢測不到。接下來我們又檢測了T-bet下游的信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然Jak2基因敲除以后抑制了T-bet的表達(dá)，但是這一過程并沒有完全抑制T-bet誘導(dǎo)蛋白之一IL-12Rβ2的表達(dá)。綜合以上實驗結(jié)果，我們得出一下結(jié)論：Jak2基因缺失主要是通過抑制 Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-be

27、t/Hlx以及相關(guān)協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子Runx3的表達(dá)，進(jìn)而影響到Th1細(xì)胞的分化。
　　三、結(jié)論
　　綜上所述，Jak2激酶缺失以后導(dǎo)致了Th1細(xì)胞發(fā)育障礙，但是促進(jìn)了有免疫調(diào)節(jié)功能的Treg細(xì)胞的發(fā)育分化，這說明Jak2激酶在Th1/Treg細(xì)胞之間的免疫平衡中起到了非常關(guān)鍵的作用。我們也用小鼠異位心臟移植模型驗證了以上結(jié)論，Jak2基因敲除明顯延長了心臟移植物的存活時間。我們的細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，Jak2激酶缺失與否并不影響 CD

28、4 T細(xì)胞的增殖能力。機制實驗我們發(fā)現(xiàn) Jak2激酶缺失主要是通過減弱IFN-γ/STAT1和 IL-12/STAT4信號通路，以及抑制Th1細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet, Hlx和Runx3的表達(dá)，進(jìn)而阻礙了Th1細(xì)胞分化發(fā)育。與此相反的是，Jak2激酶缺失并不影響IL-2/STAT5信號通路，由于此信號通路在Treg細(xì)胞分化發(fā)育中起關(guān)鍵作用，因此 Jak2激酶缺失并不影響 Treg分化，甚至由于缺乏 Th1細(xì)胞的影響而促進(jìn) Treg的