戊型肝炎規(guī)范化實驗室診斷模式的建立.pdf

1、目的：1.系統(tǒng)評估我國主流HEV抗原/抗體ELISA檢測試劑盒的診斷靈敏度、特異度及相互間結果符合度，形成可指導臨床實驗室應用的HEV血清學檢測試劑盒的質量報告，以規(guī)范戊型肝炎的實驗室診斷流程。2.設計出充分滿足臨床診斷靈敏度和特異度要求的能夠檢測HEV不同基因型病毒株的一步法熒光定量逆轉錄PCR（Real-timeRT-PCR）檢測體系；并初步建立起HEV RNA考評血清盤和質粒標準品，用于評價HEV核酸檢測的質量評估。3.建立起不依

2、賴特殊設備和專業(yè)人員操作的快捷高效檢測HEV RNA的逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)平臺。
　　方法:1.收集戊肝患者、健康體檢人群、風濕免疫病患者及巨細胞病毒(CMV)和EB病毒感染早期患者血清樣本，分別用萬泰、科華、貝爾、麗珠、新創(chuàng)HEV IgM和 IgG抗體檢測試劑盒對上述標本進行平行檢測，以考察不同試劑盒各自的診斷靈敏度和特異度及相互間的結果符合率。2.用 HEV細胞培養(yǎng)上清液作為中和抗原，通過中和抑制實驗的方

3、法來驗證各HEV抗體檢測試劑盒間檢測結果不一致時是否為真陽性。3.在HEV ORF3高度保守區(qū)設計能檢測HEV不同基因型病毒株的PCR引物和探針引物，建立起一步法(Real time RT-PCR)檢測體系；將擬擴增的HEV RNA目的基因片段構建成質粒，以建立HEV質粒DNA標準品，用于濃度標準曲線的構建；構建HEV基因1-4型病毒株細胞培養(yǎng)體系，將培養(yǎng)上清液通過陰性血清倍比稀釋的方式初步建立評價HEV RNA檢測的考評血清盤。4.在

4、HEV基因組保守區(qū)域內的6個位點區(qū)域設計4條特異性引物,建立起適用于不同基因型HEV RNA檢測的一步法逆轉錄環(huán)介導等溫擴增技術(RT-LAMP)；采集臨床患者血清標本和豬、兔糞便標本分別用RT-LAMP方法、Real time RT-PCR及逆轉錄巢式PCR(RT-nPCR)方法進行并行檢測，以驗證RT-LAMP方法的有效性；用其它病毒性肝炎病原體來驗證其特異性，通過陽性標本HEV RNA梯度倍比稀釋的方式來驗證其靈敏度。
　　

5、結果:1.不同廠家HEV IgM抗體檢測試劑盒檢測結果具有良好的一致性，診斷靈敏度普遍欠佳，均未超過85％，特異度很好，未在非戊肝患者人群中發(fā)現(xiàn)HEV IgM抗體陽性現(xiàn)象。2.不同廠家HEV IgG抗體檢測試劑盒在戊肝患者人群中檢測結果具有較好的一致性，診斷靈敏度較高(90%以上)，在非戊肝患者人群中，檢測結果有較大差異，以萬泰和科華為例，萬泰試劑盒在非戊肝患者人群中抗體陽性率在16.5%-31.9%之間，而科華陽性率僅為1.1%-3.

6、3%之間。3.通過中和抑制試驗未發(fā)現(xiàn)萬泰檢測試劑盒有假陽性現(xiàn)象，進一步說明了萬泰IgG抗體試劑盒檢測靈敏度較高，而其它幾種試劑盒容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。4. HEV抗原檢測試劑盒與IgM和IgG抗體檢測結果及HEV RNA檢測有很高的相關性，未發(fā)現(xiàn)IgM和IgG抗體均陰性而HEV抗原陽性的病例。5.本研究建立了能夠高效擴增包含兔HEV病毒株在內的基因1-4型HEV病毒株的檢測，適用于血清和糞便等標本，最低檢測限可達25copies/test

7、，較傳統(tǒng)RT-nPCR靈敏度高10倍以上；在103和106 copies/μl兩個濃度水平處，該方法批內和批間精密度分別低于2%和3%，具有很好的重復性；經臨床標本驗證分析發(fā)現(xiàn)能夠用于戊肝患者及動物宿主的血清和糞便標本檢測，且靈敏度顯著高于RT-nPCR。6.本研究構建了HEV質粒標準品及HEV RNA考評血清盤，經穩(wěn)定性驗證評估，能夠初步滿足臨床應用需求。7.本研究成功構建了適用于包含兔HEV在內基因1-4型HEV RNA RT-LA

8、MP檢測方法。該方法最低檢測限度為5copies/test，顯著優(yōu)于RT-nPCR技術，略優(yōu)于Real time RT-PCR技術。與HAV,HBV和HCV患者血清標本對無交叉反應，特異度良好。233份血清或糞便標本對該技術進行檢測效能驗證，并將該方法與Real time RT-PCR和RT-nPCR分別進行平行檢測。結果顯示RT-LAMP和Real time RT-PCR檢測陽性率顯著高于RT-nPCR，而兩者間檢測符合率高達92%，

9、未發(fā)現(xiàn)Real time RT-PCR或RT-nPCR檢測陽性而RT-LAMP檢測陰性的標本。
　　結論：1.不同廠家HEV IgM抗體檢測試劑盒之間的檢測結果差異較小，對戊肝臨床診斷的靈敏度均在80%以上，特異性較高。HEV IgG抗體檢測試劑盒較 IgM檢測試劑盒更靈敏，但診斷特異度在不同廠家之間差異較大，經綜合比較發(fā)現(xiàn)科華IgG抗體檢測試劑盒較適合于戊肝臨床診斷檢測，與IgM抗體檢測試劑盒配伍使用，能很好地彌補其靈敏度不足，

10、又能有效解決自身診斷特異度不足的問題。2.萬泰IgG抗體試劑盒較其它3種廠家靈敏度最高，更加適合于流行病學調查，鑒于科華試劑盒較低的檢測靈敏度，不適合應用于流行病學調查。3.HEV抗原檢測試劑盒與HEV RNA檢測有很好的相關性，雖然其出現(xiàn)最早，能有效縮短HEV感染的檢測窗口期，但鑒于戊肝的發(fā)病特點，當患者有癥狀就醫(yī)時抗體往往已經出現(xiàn)，因此HEV抗原檢測在臨床應用中的價值仍需進一步研究，本研究未發(fā)現(xiàn)其能提高HEV感染診斷效率的證據(jù)。4.

11、本研究建立了能夠高效擴增包含兔HEV病毒株在內的基因1-4型HEV病毒株的HEV RNA一步法Real time RT-PCR檢測體系，適用于血清和糞便等標本的檢測，具有檢測靈敏度、特異性高，重復性好等特點，值得進一步優(yōu)化后進行商品化嘗試。5.本研究構建了Realtime RT-PCR所需的質粒標準品，該標準品易制備、易精確定量，儲存條件簡單，穩(wěn)定性好。解決了HEV RNAReal time RT-PCR檢測臨床實驗室推廣應用的瓶頸。6

12、.本研究初步制備了HEV RNA檢測考評血清盤，對Real-time RT-PCR檢測HEV RNA的臨床推廣所面臨的標準化和結果可控可比的問題進行了初步探索。該血清盤目前針對我國HEV感染人群和動物宿主中主要基因型(基因4型)的特點而制備，未來仍需進一步完善豐富其覆蓋的基因型別。7.本研究初步建立了RT-LAMP技術檢測HEV RNA的新方法，在特異度、靈敏度和臨床標本檢測驗證中表現(xiàn)出了良好效果。該方法不需要昂貴的設備和繁瑣的電泳分析