Ca2+激活ROS-NFκB信號通路介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)在腎結(jié)石形成中的意義.pdf

1、第一部分遺傳性高鈣尿結(jié)石形成大鼠腎臟 miRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析
　　目的：全面了解遺傳性高鈣尿結(jié)石形成大鼠腎臟miRNA及mRNA的表達(dá)變化及其相互作用關(guān)系。
　　方法：采用高通量miRNA及mRNA生物芯片技術(shù)，尋找出在遺傳性高鈣尿結(jié)石形成大鼠（GHS大鼠）與Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠）腎臟差異表達(dá)的miRNA及mRNA。通過miRanda數(shù)據(jù)庫，預(yù)測miRNA的靶基因，選取預(yù)測的靶基因與實(shí)際表達(dá)差

2、異的交集基因進(jìn)行生物信息學(xué)的分析。通過GO分析和KEGGpathways分析尋找差異基因可能富集的功能和信號通路，并最終根據(jù)差異miRNA和mRNA構(gòu)建出miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（signal-net）。
　　結(jié)果：通過生物芯片檢測，共發(fā)現(xiàn)2418個(gè)在GHS大鼠和SD大鼠腎臟內(nèi)差異表達(dá)的mRNA和19個(gè)差異表達(dá)的miRNA。選取miRNA的預(yù)測靶基因和2418個(gè)差異表達(dá)基因的交集做GO和KEGG path

3、ways分析，共得到703個(gè)明顯富集的GO terms（包括417個(gè)上調(diào)和286個(gè)下調(diào)）以及83個(gè)明顯富集的pathways（包括75個(gè)上調(diào)和18個(gè)下調(diào)）。成功構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，rno-miR-674-5p, rno-miR-672-5p, rno-miR-138-5p and rno-miR-21-3p可能是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，而Sema5a, Lpin2, Gcnt1, Masp1, Olr1和Traf

4、3等基因在網(wǎng)絡(luò)中有最高的連接度。此外，還成功構(gòu)建差異表達(dá)的細(xì)胞信號通路網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)NFκB家族分子在特發(fā)性高鈣尿大鼠腎臟細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用。
　　結(jié)論：本研究成功鑒定了GHS大鼠腎臟內(nèi)差異表達(dá)的miRNA和mRNA，并構(gòu)建了GHS大鼠腎臟miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號通路網(wǎng)絡(luò)，為特發(fā)性高鈣尿結(jié)石病腎臟基因水平發(fā)生的改變提供了一個(gè)全局觀；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)miRNA可能在該病病理生理過程中發(fā)揮重要作用，而NFκB信號通路及其

5、下游分子的改變則是該病的核心。本項(xiàng)目為今后關(guān)于特發(fā)性高鈣尿結(jié)石病的深入研究提供了方向。
　　第二部分 Ca2+激活腎小管上皮細(xì)胞 ROS/NFκB信號通路促進(jìn)細(xì)胞黏附分子表達(dá)
　　目的：探討高鈣尿環(huán)境對腎小管上皮細(xì)胞表面黏附分子表達(dá)和草酸鈣晶體黏附的影響及其作用機(jī)制
　　方法：取GHS大鼠及SD大鼠腎臟組織，采用qRT-PCR，western blot，免疫組化檢測大鼠腎臟組織細(xì)胞內(nèi)黏附分子 ICAM-1，VCAM-1

6、及 IL-6的表達(dá)水平，用ELISA方法檢測大鼠血漿ICAM-1，VCAM-1及IL-6水平；并用western blot檢測NFκB相關(guān)分子p65和IκB表達(dá)水平和磷酸化水平；腹腔注射乙醛酸誘導(dǎo)大鼠腎臟成石，von-kossal染色觀察草酸鈣晶體在腎小管管腔內(nèi)的黏附情況。酶消化貼壁法培養(yǎng)GHS大鼠原代腎小管上皮細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面免疫標(biāo)記CK-18，CK-19及E-cadherin。用Ca2+處理GHS大鼠原代腎小管上皮細(xì)

7、胞和NRK-52E細(xì)胞，鈣離子探針觀察Ca2+內(nèi)流情況；活性氧（ROS）探針觀察細(xì)胞內(nèi)ROS生成情況；qRT-PCR，western blot檢測黏附分子表達(dá)水平和NFκB相關(guān)分子表達(dá)水平和磷酸化水平；免疫熒光檢測p65表達(dá)分布變化；草酸鈣懸液孵育細(xì)胞，觀察細(xì)胞表面晶體黏附情況；透射電鏡觀察Ca2+處理前后細(xì)胞微結(jié)構(gòu)改變。分別用ROS清除劑NAC和NFκB核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BAY11-7082預(yù)處理細(xì)胞，之后用Ca2+處理細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)上述

8、指標(biāo)變化，旨在證實(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS生成和NFκB信號通路在Ca2+刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞粘附分子表達(dá)和草酸鈣晶體黏附過程中的作用。
　　結(jié)果：GHS大鼠腎臟組織內(nèi)黏附分子ICAM-1，VCAM-1及IL-6的表達(dá)水平明顯高于普通SD大鼠，GHS血清中ICAM-1，VCAM-1及IL-6的表達(dá)也明顯高于SD大鼠；western blot檢測結(jié)果顯示，GHS大鼠腎臟組織內(nèi)p65和IκBα磷酸化水平明顯增高，乙醛酸誘導(dǎo)GHS大鼠腎小管內(nèi)草酸鈣晶體生

9、成明顯多于SD大鼠。成功培育GHS大鼠原代腎小管上皮細(xì)胞。高鈣環(huán)境可促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加，并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加。Ca2+還能促進(jìn)細(xì)胞黏附分子表達(dá)增加，促進(jìn)NFκB信號通路相關(guān)分子p65和IκBα的磷酸化及p65的核轉(zhuǎn)運(yùn)。NAC能降低細(xì)胞內(nèi)的ROS的水平，并抑制NFκB分子的磷酸化，細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和草酸鈣晶體在細(xì)胞表面的黏附。BAY11-7082亦可以抑制NRK-52E細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和草酸鈣晶體在細(xì)胞表面的黏附。