海芒果種子提取物對人肝癌HepG2細胞增殖、周期和凋亡的影響及其作用機制.pdf

1、肝癌有原發(fā)性肝癌和繼發(fā)性肝癌之分，原發(fā)性肝癌為我國常見惡性腫瘤之一，也是我國惡性腫瘤防治研究的重點。死亡率在惡性腫瘤中居第三位，僅次于胃癌和食管癌。手術切除是目前治療早期肝癌唯一有效的方法，但大多數(shù)患者就診時已達病程中晚期，手術療效受限，因而尋找新的治療方法尤為重要。隨著對腫瘤發(fā)生機制的深入研究，探討誘導腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯的方法成為提高臨床療效的新思路。強心苷是一類對心肌有興奮作用、具有強心生理活性的甾體化合物，能選擇性地作用于

2、心肌，加強心肌收縮力，臨床上用于治療充血性心力衰竭及某些心律失常。然而，這類化合物在預防和治療腫瘤方面正扮演著越來越重要的角色。在過去五年內(nèi)，許多研究已經(jīng)表明強心營對惡性細胞具有優(yōu)先選擇性殺傷作用，而不影響正常細胞的增殖。因此，強心苷有望成為一種靶向治療腫瘤的新型抗腫瘤藥物。海芒果全株有毒，其中果仁的毒性最大，其毒性在于海芒果毒素，其分子結(jié)構(gòu)與異羥洋地黃毒甙(一種強心劑)非常相似，會阻斷鈣離子在心肌中的傳輸通道，造成中毒者迅速死亡。顯然

3、，了解海芒果毒素的毒理、藥理及其影響因素對開發(fā)海芒果有重要意義。同時，海芒果在醫(yī)藥方面也有開發(fā)價值。海芒果中含有多種強心苷類化合物，均為甲型強心苷。海芒果植株還含具有抗皮膚癌、乳腺癌和肺癌活性的強心苷。Laphookhieo等從白花海芒果種子中成功分離出一系列具有抗癌活性的強心苷類化合物。β-D-glucosyl-(14)-α-L-thevetosides of17β-digitoxigenin(GHSC-73)和2'-eoi-2'-O

4、-Acetylthevetin B(GHSC-74)是從植物海芒果種子中提取的兩種具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，屬強心苷。國內(nèi)外文獻未曾報道過這兩種化合物的抗腫瘤活性。而HepG2細胞來源于人肝癌組織，與正常肝細胞在細胞增殖動力學上具有同源性，因此本論文選取人肝癌細胞株HepG2作為實驗對象，來研究GHSC-73和GHSC-74對其增殖，周期和凋亡的影響及其作用機制。 第一部分β-D-glucosyl-(1-4)-α-L-theve

5、tosides of17β-digitoxigenin(GHSC-73)對人肝癌HepG2細胞增殖、周期和凋亡的影響及其作用機制 目的： 研究β-D-glucosyl-(1-4)-α-L-thevetosides of17β-digitoxigenin(GHSC-73)對人肝癌HepG2細胞增殖，周期和凋亡的影響及其作用機制。 方法： 采用MTT法檢測GHSC-73對人肝癌細胞株HepG2，人張氏肝細胞C

6、hangliver和小鼠胚胎成纖維細胞株3T3-Swiss albino增殖的影響；采用流式細胞儀Propidium Iodide(PI)單標法檢測GHSC-73對HepG2細胞周期進程的影響；Real-time PCR檢測S期相關基因mRNA表達的變化；采用流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙標法和P1單標的sub-G1(細胞亞二倍體凋亡峰)法檢測細胞凋亡率；應用Hoechst33342和DAPI熒光染色法觀察GHSC-73

7、處理后細胞形態(tài)的變化；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA梯狀條帶；western blotting檢測凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kapperB，NF-κB)亞基p65蛋白表達水平；采用流式細胞儀JC-1染色法檢測線粒體膜電位(△ψm)水平；免疫熒光染色檢測AIF和NF-κB亞基p65的核移位；采用流式細胞儀檢測熒光探針DCFH-DA標記的細胞內(nèi)

8、活性氧(reactive oxygen species，ROS)；利用caspase-3和caspase-8活性檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)caspase-3和caspase-8酶活性；采用流式細胞儀異硫氰酸熒光素(FITC)標記的anti-human Fas抗體和藻紅蛋白(PE)標記的anti-human FasL抗體檢測細胞內(nèi)Fas和FasL的蛋白表達水平。 結(jié)論： GHSC-73可選擇性的控制人肝癌HepG2細胞增殖，但是

9、不影響人張氏肝細胞Chang liver和小鼠胚胎成纖維細胞株3T3-Swiss albino的增殖。GHSC-73可通過S期阻滯和細胞凋亡來抑制HepG2細胞的增殖，并且通過Caspase非依賴的凋亡誘導因子介導的線粒體通路和抑制NF-κB活性來誘導HepG2細胞凋亡，但是凋亡過程并不依賴活性氧的產(chǎn)生和Fas/FasL的相互作用。GHSC-73具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，并能使細胞周期進程發(fā)生變化。 第二部分2'-epi-2'

10、-O-Acetylthevetin B(GHSC-74)對人肝癌HepG2細胞增殖、周期和凋亡的影響及其作用機制 目的：研究2'-epi-2'-O-Acetylthevetin B(GHSC-74)對人肝癌HepG2細胞增殖、周期和凋亡的影響及其作用機制。 方法：采用MTT法檢測GHSC-74對人肝癌細胞株HepG2，人張氏肝細胞Changliver和小鼠胚胎成纖維細胞株3T3-Swiss albino增殖的影響；采用流

11、式細胞儀Propidium Iodide(PI)單標法檢測GHSC-74對HepG2細胞周期進程的影響；利用Giemsa染色檢測細胞分裂指數(shù)(Mitotic Index，MI)；采用流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙標法和PI單標的sub-G1(細胞亞二倍體凋亡峰)法檢測細胞凋亡率；應用Hoechst33342和DAPI熒光染色法觀察GHSC-74處理后細胞形態(tài)的變化；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA梯狀條帶；western

12、blotting檢測凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)，CDC2，Cyclin B1和Bcl-2蛋白表達水平；采用流式細胞儀JC-1染色法檢測線粒體膜電位(Δψm)水平；免疫熒光染色檢測AIF；采用流式細胞儀檢測熒光探針DCFH-DA標汜的細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species．ROS)；采用流式細胞儀異硫氰酸熒光素(FITC)標記的anti-human Fas抗體和藻紅蛋白

13、(PE)標記的anti-human FasL抗體檢測細胞內(nèi)Fas和FasL的蛋白表達水平；采用流式細胞儀熒光探針Fluo-3 AM檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度。 結(jié)論： GHSC-74可選擇性的控制人肝癌HepG2細胞增殖，但是不影響人張氏肝細胞Chang liver和小鼠胚胎成纖維細胞株3T3-Swiss albino的增殖。GHSC-74可通過S和G2期阻滯和細胞凋亡來抑制HepG2細胞的增殖，并且通過Caspase非依賴的