microRNA-33在代謝綜合征相關(guān)HDL異常中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、背景：
　　 代謝綜合征(metabolicsyndrome，MS)患者體內(nèi)高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低總是與甘油三酯(TG)升高相伴而行，而小鼠代謝綜合征模型中無(wú)類似人體HDL-C降低的改變，這些現(xiàn)象仍無(wú)明確解釋。我們觀察到脂肪細(xì)胞與肝細(xì)胞共培養(yǎng)可影響肝細(xì)胞固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1c）及ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ABCA1)表達(dá)，結(jié)合最新發(fā)現(xiàn)SREBP基因內(nèi)含子中隱藏了調(diào)節(jié)ABCA1的microRNA-33，

2、我們推測(cè)代謝綜合征的相關(guān)因素可調(diào)節(jié)SREBP1-miR33b，導(dǎo)致TG升高與HDL-C同步降低，而小鼠SREBP1基因中缺乏miR-33b是人鼠代謝綜合征血脂異常差異的因素之一。
　　 目的：
　　 探討代謝綜合征相關(guān)因素對(duì)肝細(xì)胞SREBP1/miR-33b的影響及其在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞HDL代謝中的作用。
　　 方法：
　　 分別以100nM胰島素和200ng/mlTNF-α干預(yù)人原代肝臟細(xì)胞，以不加干預(yù)的細(xì)胞

3、為對(duì)照組，干預(yù)24小時(shí)后提取各組細(xì)胞的總RNA及蛋白，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timepolymerasechainreaction)比較各組中miR-33b，SREBP-1c，SREBP-2，ABCA1，ABCG1，APOA1基因的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)免疫印跡（WesternBlot）方法檢測(cè)各組中ABCA1及ABCG1的蛋白表達(dá)量。通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)法檢測(cè)肝細(xì)胞膽固醇流出率。利用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000分別以m

4、iR-33b模擬物（mimic50nM）和miR-33b抑制物（inhibitor100nM）轉(zhuǎn)染人原代肝細(xì)胞，6小時(shí)后再以100nM胰島素干預(yù)，24小時(shí)后PCR檢測(cè)miR-33b，SREBP-1c及ABCA1基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1.與對(duì)照組相比，胰島素干預(yù)人原代肝細(xì)胞24小時(shí)后，可見(jiàn)miR-33b及SREBP-1c表達(dá)明顯上調(diào)，ABCA1，ABCG1和APOA1基因表達(dá)下調(diào)，其中ABCA1和ABCG

5、1蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)相應(yīng)下降，apoA-Ⅰ介導(dǎo)的膽固醇流出效率下降，其變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。而胰島素干預(yù)后SREBP-2基因無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　 2.與對(duì)照組相比，TNF-α干預(yù)人原代肝細(xì)胞24小時(shí)后，可見(jiàn)miR-33b及SREBP-1c表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)ABCA1和APOA1基因表達(dá)也出現(xiàn)下降，而ABCG1表達(dá)升高，其變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。TNF-α干預(yù)后SREBP-2基因無(wú)明顯變化(

6、P＞0.05)。
　　 3.過(guò)表達(dá)miR-33b可以下調(diào)人原代肝細(xì)胞中ABCA1表達(dá)水平，沉默miR-33b可以上調(diào)ABCA1表達(dá)水平;過(guò)表達(dá)miR-33b后，胰島素干預(yù)可以進(jìn)一步抑制ABCA1，而沉默miR-33b后，胰島素對(duì)ABCA1的抑制作用消失（均P＜0.05）。
　　 4.無(wú)論過(guò)表達(dá)或沉默miR-33b后，SREBP-1c表達(dá)均無(wú)明顯變化，P＞0.05。而同時(shí)加入胰島素后，SREBP-1c表達(dá)均明顯上升，P＜0