心律失常后心肌組織中腦鈉肽的表達(dá)變化及法醫(yī)學(xué)意義.pdf

1、目的：
　　本研究分為兩部分，第一部分動物實驗通過氯化鈣(CaCl2)誘導(dǎo)大鼠心律失常，通過免疫組織化學(xué)(IHC)染色、Western Blot、Real-time PCR、ELISA探究大鼠心律失常后不同時間點心肌組織中BNP蛋白、mRNA的表達(dá)規(guī)律，以及血清中BNP濃度的變化規(guī)律;第二部分人體標(biāo)本實驗通過免疫組織化學(xué)染色、HE染色、免疫膠體金法以及分子病理學(xué)方法來探究ARVC/D死者心肌組中的BNP以及心包液中BNP的表達(dá)情況

2、，以期為致死性心律失常的法醫(yī)病理學(xué)診斷提供依據(jù)。
　　方法：
　　一、心律失常動物模型的建立
　　由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供的健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重300～350g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將其隨機分為2組（生理鹽水對照組、實驗組），每個組再分成6個亞組(0min組、10min組、30min組、1h組、3h組、6h組)，每個亞組6只大鼠。實驗組通過微量注射泵定時定量注射CaCl2來誘導(dǎo)

3、心律失常，建立大鼠心律失常模型，并用Powerlab監(jiān)測記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)大鼠心電改變情況，在時間節(jié)點時泵入兩倍劑量的CaCl2誘導(dǎo)惡性心律失常來處死動物。生理鹽水對照組在相同時間注入與CaCl2等量的生理鹽水作為對照，并用Powerlab監(jiān)測記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)大鼠心電改變情況，在時間節(jié)點通過頸椎脫位處死動物。實驗過程中不滿足實驗條件的動物均被剔除實驗組。大鼠處死后，采集心血、分離血清用于ELISA檢測，取出大鼠心臟，將大鼠心臟橫斷為兩部分。上

4、半部分心肌放入4％多聚甲醛固定、制作蠟塊，分別用于HE染色、免疫組織化學(xué)染色;下半部分心肌組織提取蛋白及RNA，用于Western blot和Real-time PCR檢測。
　　二、人體標(biāo)本實驗分組
　　心源性猝死案例的主要尸檢所見為:急性心肌梗死案例可見新鮮的局部心肌損傷（心肌纖維嗜伊紅染色增強，典型的缺血性凝固性壞死伴或不伴心肌間質(zhì)出血，或炎性細(xì)胞浸潤）;心肌缺血組案例可見彌漫性間質(zhì)充血、水腫，片狀心肌嗜伊紅染色增強，

5、部分伴有多發(fā)出血和收縮帶樣改變，但無心肌壞死;致心律失常型右室心肌病案例遵循Protonotarios和Basso的診斷標(biāo)準(zhǔn)，可見嚴(yán)重右心室擴張及右室游離壁心肌組織被纖維、脂肪替代，心肌萎縮，且沒有冠狀動脈病變。
　　三、HE及IHC染色
　　取實驗動物的心臟及人體心肌（左心室側(cè)壁、室間隔、右心室側(cè)壁）經(jīng)4％多聚甲醛固定24h、脫水、透明、石蠟包埋，制作成5μm的切片后，再進行脫蠟、水化，進行HE及IHC染色。
　　四

6、、Western blot檢測大鼠心肌中BNP的表達(dá)
　　通過蛋白裂解液提取動物實驗的生理鹽水組及心律失常組大鼠心肌總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取30ug總蛋白樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離出的蛋白轉(zhuǎn)印在PVDF膜上，經(jīng)過5％脫脂奶粉封閉2h、兔抗BNP一抗(1∶1000)4℃過夜孵育、山羊抗兔二抗孵育2h，最后用ECL發(fā)光液發(fā)光，檢測BNP條帶(13.6kD)及GAPDH條帶(34kD)平均光密度值，并以其二者比值作為B

7、NP的相對表達(dá)量。
　　五、ELISA法檢測大鼠血清中BNP的濃度
　　動物處死后立刻開胸用注射器吸取心血，并3000r/min、離心15min，留取血清，按照試劑盒說明書進行ELISA實驗，根據(jù)紫外分光光度計讀取的各樣本及標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度值計算各樣品的BNP濃度。
　　六、免疫膠體金法檢測人體心包液中NT-proBNP濃度
　　解剖時留取心包液用生理鹽水稀釋2倍，按試劑盒說明書滴加稀釋后樣品，室溫靜置15min，

8、通過免疫定量分析儀讀取NT-proBNP的濃度。
　　七、Real-time PCR法檢測大鼠及人體心肌標(biāo)本中BNP mRNA的表達(dá)
　　使用RNAiso Plus試劑盒提取大鼠及人體心肌標(biāo)本中的總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定每個RNA樣品的OD值及濃度，當(dāng)OD260/280比值在1.8-2.0時認(rèn)為RNA濃度和純度合格，將樣品部分RNA稀釋成200ng/μl，并按PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑

9、盒說明進行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA使用SYBR(@)Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒及ABI PRISM(@)7500 Real-time PCR System進行PCR擴增，通過ΔΔCT法以GAPDH為內(nèi)參來計算cDNA的相對量，來分析mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　一、心電監(jiān)測
　　心電監(jiān)測結(jié)果顯示生理鹽水對照組的大鼠心電未發(fā)生明顯改變，實驗組大鼠在給予4mg/100g劑量的CaCl2時，心電檢測

10、結(jié)果可見不同類型的心律失常波形，大多數(shù)為竇性心動過速、竇性停搏及各種類型的傳導(dǎo)阻滯，部分大鼠出現(xiàn)輕微的室性心律失常，當(dāng)給予2倍劑量CaCl2(8mg/100g)時，可見到室性心動過速、室顫。
　　二、HE及IHC染色
　　動物實驗各生理鹽水對照組大鼠心肌未見明顯病理組織學(xué)改變，心肌結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊、橫紋可見、細(xì)胞核完整。
　　人體標(biāo)本ARVC/D組心肌HE染色可見右室游離壁心肌組織被纖維、脂肪替代，心肌萎縮，且冠狀動

11、脈病變;AMI組案例可見局部心肌損傷，包括心肌纖維嗜伊紅染色增強，典型的缺血性凝固性壞死伴或不伴心肌間質(zhì)出血，或炎性細(xì)胞浸潤;IHD組案例可見彌漫性間質(zhì)充血、水腫，片狀心肌嗜伊紅染色增強，部分伴有多發(fā)出血和收縮帶樣改變，但無心肌壞死。
　　三、Western blot檢測大鼠心肌中BNP蛋白的表達(dá)
　　生理鹽水對照組中，各時間組BNP的表達(dá)基本沒有統(tǒng)計學(xué)差異;實驗組中，0min組中BNP表達(dá)量沒有改變;10min時開始升高，

12、30min時達(dá)到第一個峰值;隨后開始下降，在3h組降到最低，在6h組再次升高，達(dá)到第二個峰值，實驗組各時間段與相應(yīng)對照組比較除0min組、3h組外均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　四、ELISA法檢測大鼠血清中BNP的濃度
　　在生理鹽水對照組中，各個時間組血清中BNP濃度沒有統(tǒng)計學(xué)差異。實驗組中，血清BNP濃度在0min組、10min組幾乎沒有改變，而在30min后連續(xù)升高，直至6h達(dá)到峰值。實驗組各時間段與相應(yīng)對照組比較除0min組

13、外均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　五、免疫膠體金法檢測人體心包液中NT-proBNP的濃度
　　參照臨床上NT-proBNP的參考值，除對照組外其他各組心包液中NT-proBNP濃度均升高。與對照組相比較，ARVC/D組、IHD組及AMI組有統(tǒng)計學(xué)差異，而DAR組沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　六、Real-time PCR檢測心肌中BNPmRNA的表達(dá)
　　動物實驗生理鹽水對照組中，各時間組mRNA表達(dá)量沒有統(tǒng)計學(xué)差異。實驗組，B

14、NP mRNA表達(dá)量在0min時沒有改變，10min時迅速上升、并達(dá)到第一個峰值;30min時開始下降，1h下降至最低;3h再一次爬升，第二個高峰出現(xiàn)在6h，實驗組各時間段與相應(yīng)對照組比較除0min組外均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　人體標(biāo)本實驗ARVC/D組、IHD組及AMI組中左、右心室BNP mRNA的表達(dá)均高于對照組。DAR組中左、右心室BNP mRNA表達(dá)與對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但在左心室的表達(dá)低于IHD組和AMI組。

15、　　七、心包液中NT-proBNP及心肌中BNP mRNA與性別、年齡、心臟重量、雙肺重量的相關(guān)性分析
　　通過Spearman秩相關(guān)檢驗心包液中NT-proBNP及心肌中BNP mRNA與性別、年齡、心臟重量、雙肺重量的相關(guān)性，在所有案例中，心包液中NT-proBNP濃度與性別、年齡、心臟重量、雙肺重量沒有相關(guān)性(p＞0.05)，但與左心室前壁心肌BNP mRNA、左心室后壁心肌BNP mRNA、右心室心肌BNP mRNA呈現(xiàn)輕

16、度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為:r=0.418(p=0.001)、r=0.410(p=0.020)、r=0.383(p=0.004)。心臟重量與左心室前壁心肌BNP mRNA、左心室后壁心肌BNP mRNA、右心室心肌BNP mRNA呈現(xiàn)輕度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為:r=0.426(p=0.001)、r=0.458(p=0.000)、r=0.310(p=0.02)。ARVC/D組中各參數(shù)間均無相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1、CaCl2

17、誘導(dǎo)心律失常后，大鼠心肌組織及血清中BNP的表達(dá)增加。
　　2、心臟對短時間的心律失常會產(chǎn)生代償作用，而對長時間心律失常失去了代償作用，心臟功能出現(xiàn)衰竭。
　　3、在短時間(＜10min)心律失常后，大鼠心肌組織中BNP mRNA的表達(dá)升高而其蛋白及血清中BNP并未升高。
　　4、在長時間(＞1h)心律失常后，大鼠心肌組織中BNP mRNA、蛋白及血清中BNP均明顯升高。
　　5、致心律失常型右室心肌病患者的心肌