“補腎活血舒筋方”對骨髓間充質干細胞遷移及NF-κB、CXCR4表達的影響.pdf

1、頸腰痛是骨傷科臨床最常見的疾病，據(jù)統(tǒng)計80％的人一生中會為此就診[1]。椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration，IVDD)是頸腰痛發(fā)病重要的病理因素，但退變的機理目前還不十分明確，有關椎間盤退變的機理及減緩椎間盤退變的方法是當今研究的熱點。
　　研究目的：
　　由于椎間盤缺乏血管且細胞數(shù)量少，其本身幾乎不能自我修復。有研究發(fā)現(xiàn)，應用骨髓間充質干細胞(Bone marrow derived

2、 mesenchymal stem cells，BMSCs)治療，可以促進椎間盤組織的再生。由于BMSCs的來源有限及植入問題，促進內源性BSMDs歸巢成為一種新的選擇。臨床研究發(fā)現(xiàn)，應用“補腎活血舒筋方”治療頸腰痛療效顯著，既往實驗證明，“補腎活血舒筋方”可以通過調節(jié)核因子(Nuclear factor-κB，NF-κB)抑制炎癥反應和椎間盤退變的發(fā)展。因此，我們提出假說，“補腎活血舒筋方”通過調節(jié)NF-κB/CXCR4促進BMSCs

3、歸巢至退變的椎間盤，進而修復退變的椎間盤，達到治療頸腰痛的目的。本研究通過體外實驗觀察“補腎活血舒筋方”對大鼠BMSCs增殖、遷移及NF-κB、CXCR4表達的影響，并初步探討B(tài)MSCs遷移的可能機制。
　　研究方法：
　　取4周齡SPF級SD大鼠，分離其后肢股骨，采用全骨髓貼壁法分離并提取大鼠BMSCs，放置于含有預熱的培養(yǎng)基及10％胎牛血清的T25培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，應用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。取培養(yǎng)純化至第3代后的BMS

4、Cs分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導分化，并用油紅O及茜素紅染色鑒定分化后的細胞。制備“補腎活血舒筋方”中藥原液，取20只成年SD大鼠隨機分成四組，高、中、低中藥血清組分別灌服高、中、低濃度中藥原液，對照組灌服等體積雙蒸水，制備高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清，采用中藥化學指紋圖譜對中藥原液及含藥血清進行質量控制。將高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長良好的第3代BMSCs干預培養(yǎng)24h，應用Cell

5、CountingKit-8(CCK-8)法檢測各組BMSCs的增殖情況。將高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長良好的第3代BMSCs干預培養(yǎng)48h，應用transwell小室觀察不同濃度含藥血清作用后BMSCs的遷移情況。將高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與生長良好的第3代BMSCs干預培養(yǎng)48h，應用Western Bloting檢測NF-κB、CXCR4蛋白的表達。
　　結果：
　　

6、1.大鼠BMSCs的形態(tài)學觀察及鑒定:全骨髓貼壁方法所獲得的BMSCs培養(yǎng)5-7日即可傳代，傳代后增殖速度較原代明顯增快，3d左右可融合達80％。第3至第5代細胞純化程度高，細胞增殖能力強;傳代后培養(yǎng)的BMSCs呈紡錘形或多角形，細胞數(shù)目多、排列緊密時可呈漩渦狀排列。成脂誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)BMSCs，每三天可觀察到改變，誘導結束后觀察到細胞內被油紅O染紅的脂滴;成骨誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)BMSCs，每三天可觀察到改變，誘導14天后培養(yǎng)基內可

7、見能夠被茜素紅染色的鈣結節(jié)。
　　2、“補腎活血舒筋方”含藥血清的制備:液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)儀在中藥原液中檢測到12種有效成分，其中7種入血，血清樣品中以阿魏酸（川芎、當歸）、川續(xù)斷皂苷（續(xù)斷）、原兒茶酸（狗脊）含量最高，含藥血清中者三種有效成分含量具有濃度梯度差。
　　3、“補腎活血舒筋方”對BMSCs增殖及遷移的影響: CCK-8結果顯示，各濃度含藥血清組細胞生存率與對照組有明顯區(qū)別，P＜0.05，但是各濃度

8、含藥血清組之間差異不顯著，P＞0.05。將高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血清及空白血清與BMSCs干預培養(yǎng)48h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組上室下側均可見細胞，說明BMSCs存在遷移行為。其中，與對照組比較，低濃度含藥血清組遷移數(shù)目增多，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。中、高濃度含藥血清組遷移細胞數(shù)目明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中高濃度含藥血清組遷移細胞數(shù)最多。高、中、低濃度含藥血清組之間差異有統(tǒng)計學意

9、義(P＜0.05)。
　　4、“補腎活血舒筋方”對NF-κB、CXCR4蛋白表達的影響:Western bloting結果顯示，各實驗組NF-κB、CXCR4蛋白均有表達，與對照組比較，高、中、低濃度“補腎活血舒筋方”含藥血組NF-κB、CXCR4蛋白表達量增高明顯(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。高、中、低濃度含藥血清組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　“補腎活血舒筋方”可促進大鼠BMSCs