mIFN-λ3真核表達載體的構(gòu)建及其在HBV復(fù)制小鼠模型上抗病毒機制研究.pdf

1、目的:
　　2003年國外兩個獨立的研究小組，發(fā)現(xiàn)一組新型干擾素即IFN-λ家族，包括IFN-λ1(IL-29)，IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。其與相應(yīng)的受體結(jié)合可以激活JAK-STAT信號通路從而發(fā)揮抗病毒感染、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)的作用。相比IFN-α，IFN-λ作用于肝細胞后，肝細胞內(nèi)JAK-STAT信號通路中關(guān)鍵分子STAT1/2磷酸化時間明顯延長。且其受體在血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)分布明顯少于IFN-

2、α，所以有望用于臨床上IFN-α治療副作用大或無應(yīng)答的患者。
　　本研究擬通過構(gòu)建小鼠IFN-λ3真核表達質(zhì)粒，檢測mIFN-λ3的表達情況。并將構(gòu)建好的質(zhì)粒通過高壓尾靜脈注射的方法，注入小鼠體內(nèi)，研究其在小鼠體內(nèi)是否能發(fā)揮抗HBV作用及其相關(guān)機制，為IFN-λ用于臨床治療慢性乙肝患者提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、構(gòu)建小鼠IFN-λ3（mIFN-λ3）的質(zhì)粒，設(shè)計特異性引物，通過 PCR擴增小鼠IFN-λ3編碼區(qū)

3、全長，將其克隆至克隆載體pMD18-T載體進一步擴增。
　　2、將pMD18-T-mIFN-λ3及真核表達載體pIRES2-EGFP分別用限制內(nèi)切酶salⅠ和BamHⅠ雙酶切后，再用DNA連接酶進行連接，構(gòu)建雙順反子表達載體pIRES2-EGFP-mIFN-λ3（pmIFN-λ3）。
　　3、使用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將構(gòu)建好的表達載體pIRES2-EGFP-mIFN-λ3轉(zhuǎn)染BHK細胞及通過高壓尾靜脈注射

4、至小鼠體內(nèi)，檢測mIFN-λ3的表達。
　　4、收集BHK-IFN-λ3的培養(yǎng)上清中表達的mIFN-λ3，檢測其抗腫瘤細胞增殖及抗病毒生物學活性。
　　5、通過高壓尾靜脈注射pAAV-HBV1.2質(zhì)粒構(gòu)建小鼠HBV復(fù)制模型，同時分別高壓尾靜脈注射pmIFN-λ3、pmIFN-α4、pmIFN-λ3聯(lián)合pmIFN-α4，觀察pmIFN-λ3及其聯(lián)合pmIFN-α4在小鼠HBV復(fù)制模型中抗HBV作用。
　　6、使用ELIS

5、A方法，檢測不同時間點小鼠體內(nèi)mIFN-λ3、mIFN-α4、HBsAg、HBeAg表達情況。
　　7、使用HE染色的方法檢測各組不同時間點小鼠肝臟炎癥變化。
　　8、收集小鼠血清及肝臟總DNA，使用實時定量PCR（RT-qPCR）檢測小鼠血清及肝臟中HBVDNA的變化。
　　9、提取小鼠肝臟總RNA，利用特異性引物進行RT-qPCR，檢測肝內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子IRF3、IRF5、IRF7、ISG15、USP18、MX1及OAS

6、的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建雙順反子表達質(zhì)粒pIRES2-EGFP-mIFN-λ3，經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定，與已知的序列完全吻合，并且成功表達mIFN-λ3。
　　2、pIRES2-EGFP-mIFN-λ3瞬時轉(zhuǎn)染能在BHK細胞中高效表達，24h細胞上清中mIFN-λ3濃度高達1750pg/ml，并可以維持表達高峰至72h。
　　3、BHK細胞瞬時轉(zhuǎn)染表達的mIFN-λ3，能有效抑制A549細胞

7、的增殖，并且具有抗EMCV病毒的保護作用。
　　4、mIFN-λ3在小鼠乙肝復(fù)制模型中，可以抑制小鼠血清中HBsAg的表達至15dpi（days post injection，注射后天數(shù)），抑制血清中HBeAg的表達至20dpi，抑制血清中HBV DNA的表達至30dpi；而IFN-λ3聯(lián)合IFN-α4可以抑制小鼠血清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表達至30dpi，但是不能抑制肝臟中HBV DNA的復(fù)制。
　　5

8、、小鼠HBV復(fù)制模型各時期各組小鼠肝臟匯管區(qū)可見不同程度的炎癥表現(xiàn)。其中以HBV1.2組及HBV1.2+mIFN-λ3組較為明顯，提示IFN-α4及IFNλ3+IFN-α4具有良好抑制炎癥細胞浸潤的作用，而單獨IFN-λ3則作用不明顯。
　　6、mIFN-λ3單獨作用時，肝內(nèi)IRF3、IRF5、IRF7、ISG15、USP18、OAS及MX1較HBV1.2組輕度升高，但均無統(tǒng)計學差異；mIFN-λ3聯(lián)合mIFN-α4作用時，dpi

9、24h可見肝內(nèi)IRF7、ISG15、USP18、OAS及MX1較其他各組有均明顯升高，且dpi20d、30d及60d均有不同程度的升高，提示mIFN-λ3聯(lián)合mIFN-α4在HBV小鼠復(fù)制模型中可通過激活JAK-STAT信號通路發(fā)揮一定的抗HBV效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1、本實驗成功構(gòu)建小鼠IFN-λ3的表達質(zhì)粒（pIRES2-EGFP-mIFN-λ3），可以在BHK細胞和小鼠肝臟中高效表達。
　　2、BHK瞬時轉(zhuǎn)染表

10、達的mIFN-λ3具有抑制A549腫瘤細胞增殖及抗EMCV病毒的保護作用。
　　3、在小鼠HBV復(fù)制模型中，共注射pAAV-HBV1.2及pmIFN-λ3組與單獨注射pAAV HBV1.2組進行比較，mIFN-λ3明顯抑制HBV復(fù)制的作用維持至15dpi。
　　4、在小鼠HBV復(fù)制模型中，mIFN-λ3聯(lián)合mIFN-α4與單獨注射pAAV-HBV1.2組進行比較，血清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA的表達明顯受到抑制

11、，且肝內(nèi)的IRF3, IRF5, IRF7, ISG15, USP18, OAS and MX1等干擾素刺激因子及抗病毒蛋白的表達升高，說明兩者聯(lián)合可以通過激活JAK-STAT信號通路發(fā)揮抗HBV的作用。
　　創(chuàng)新點及不足：
　　1、構(gòu)建mIFN-λ3表達質(zhì)粒，通過慢性小鼠乙肝模型，研究mIFN-λ3及其聯(lián)合IFN-α4在此模型上抗HBV作用及機制。
　　2、mIFN-λ3高壓尾靜脈注射體內(nèi)很快清除，不能維持小鼠體內(nèi)m