表達(dá)人INF-α真核表達(dá)載體抗HBV效應(yīng)及機制研究.pdf

1、研究目的:
　　 目前全球約有四億慢性乙型肝炎(CHB)患者，全世界每年約有一百萬人死于乙肝導(dǎo)致的肝癌和肝硬化，其中超過三分之一的病例發(fā)生在我國。世界衛(wèi)生組織也已將HBV劃為自然存在的人類最重要的致癌因素之一。HBV的感染給我國人民的身體健康造成了嚴(yán)重危害，也給國家和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。
　　 在CHB的臨床治療實踐中，因同時兼具直接抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能，干擾素-α(IFN-α)及其衍生物成為抗病毒治療的一線用藥，

2、特別是對于年齡較小、病毒載量較低、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的水平較高的患者，以IFN-α為主的治療具有非常明顯的優(yōu)勢。但由于普通干擾素分子質(zhì)量較小，血漿半衰期較短，需頻繁地注射給藥，患者的依從性較差;而聚乙二醇化的IFN-α(Peg-IFN-α)，雖然血漿半衰期有所提高，但其生物學(xué)活性明顯降低，此外兩者都具有較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，限制了其療效的進(jìn)一步發(fā)揮。因此，如何提高IFN-α的療效對HBV的治療起著至關(guān)重要的作用。
　　

3、隨著分子生物學(xué)技術(shù)和分子藥物學(xué)的不斷充實和發(fā)展，以基因和細(xì)胞工程為基礎(chǔ)的基因治療，為人類攻克眾多疾病帶來了新的希望?；蛑委熅哂袀鹘y(tǒng)藥物療法所不具備的特殊優(yōu)勢，包括持續(xù)給藥、靶向給藥等。因此，我們提出采用含有人IFN-α基因的質(zhì)粒為載體，以期增強IFN-α的局部表達(dá)，探索優(yōu)化干擾素產(chǎn)生和應(yīng)答的持續(xù)時間，從而取得更好的抑制HBV效果，為設(shè)計和利用基于IFN-α的新型抗HBV基因工程藥物提供有益的啟示。
　　 研究方法:
　　

4、 首先，以含有HBV基因的人肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15及其不含HBV的對照細(xì)胞HepG2為研究模型，采用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pSecTagB-IFN-α轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞，通過半定量RT-PCR和ELISA檢測轉(zhuǎn)染后IFN-α的表達(dá)情況;然后，用實時定量PCR、ELISA，檢測轉(zhuǎn)染pSecTagB-IFN-α后對HepG2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及抗原表達(dá)等的影響，以此作為評價內(nèi)源性表達(dá)的IFN-α抗病毒生物學(xué)效應(yīng)的指標(biāo);隨后，采用

5、半定量RT-PCR、實時定量PCR、westernblot對內(nèi)源性表達(dá)的IFN-α抗HBV效應(yīng)的機制進(jìn)行探討，檢測轉(zhuǎn)染后對JAK-STAT信號通路活化及抗病毒蛋白表達(dá)的影響;采用實時定量PCR和ELISA，比較內(nèi)源性表達(dá)IFN-α與外加IFN-α對HBV的作用效果，以及比較內(nèi)源性表達(dá)IFN-α和拉米夫定聯(lián)用與外加IFN-α和拉米夫定聯(lián)用后對HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及抗原表達(dá)等的影響;最后采用流式細(xì)胞術(shù)和半定量RT-PCR檢測內(nèi)源性表達(dá)的IFN-

6、α對肝癌細(xì)胞表面MHCⅠ和Fas分子的影響。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)重組質(zhì)粒(pSecTagB-IFN-α)可在肝癌細(xì)胞中有效表達(dá)。采用pSecTagB-IFN-α轉(zhuǎn)染HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞在其細(xì)胞上清中均可檢測到較高水平IFN-α的分泌。
　　 (2)轉(zhuǎn)染后IFN-α的表達(dá)抑制了HepG2.2.15細(xì)胞中HBV的復(fù)制。在肝癌細(xì)胞HepG2.2.15中內(nèi)源性表達(dá)的IFN-α可產(chǎn)生以HBs、H

7、Bc的基因水平及HBVDNA載量、e抗原和表面抗原的下降為主要特征的抗HBV作用。
　　 (3)IFN-α的表達(dá)激活了JAK-STAT信號通路并誘導(dǎo)抗病毒蛋白的產(chǎn)生。轉(zhuǎn)染pSecTagB-IFN-α后可使細(xì)胞中的JAK-STAT信號通路激活，促進(jìn)了肝癌細(xì)胞中抗病毒蛋白ISG15、OAS-1、IFIT-1和IFIT-3的表達(dá)。
　　 (4)轉(zhuǎn)染pSecTagB-IFN-α后肝細(xì)胞中雙鏈RNA受體上調(diào)。內(nèi)源性表達(dá)的IFN-α

8、，使RIG-I、MDA-5、LGP-2、PKR和TLR3在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)都有不同程度的上調(diào)。
　　 (5)內(nèi)源性表達(dá)的IFN-α比外源IFN-α有更強的抗HBV作用。在HepG2.2.15細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染IFN-α表達(dá)載體與同等劑量的IFN-α胞外刺激相比，轉(zhuǎn)染pSecTagB-IFN-α有更為明顯的抗HBV作用，包括HBx、HBs、HBc的基因水平及HBVDNA載量、e抗原和表面抗原的降低。
　　 (6)內(nèi)源性表達(dá)的IF

9、N-α與拉米夫定聯(lián)合使用具有更明顯的抗HBV效果。轉(zhuǎn)染pSecTagB-IFN-α與拉米夫定聯(lián)合使用可產(chǎn)生比外加IFN-α與拉米夫定聯(lián)用組更為明顯的HBx、HBs、HBc的基因水平及HBVDNA載量、e抗原和表面抗原的下降。
　　 (7)轉(zhuǎn)染pSecTagB-IFN-α可增強MHCI和Fas的表達(dá)。內(nèi)源性表達(dá)的IFN-α可在一定程度上上調(diào)肝癌細(xì)胞表面MHCⅠ和Fas的表達(dá)水平。
　　 結(jié)論及意義:
　　 本實驗采

10、用含有人IFN-α基因的重組質(zhì)粒(pSecTagB-IFN-α)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，可在細(xì)胞上清中分泌較高水平的IFN-α并發(fā)揮對HBV的抑制功能。通過機制研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染IFN-α表達(dá)載體后促進(jìn)了一系列抗病毒蛋白和雙鏈RNA受體的表達(dá)，與等劑量的外源性IFN-α刺激相比，內(nèi)源性表達(dá)IFN-α具有更為顯著的抗HBV作用，與拉米夫定聯(lián)合應(yīng)用后也顯示出比對外加IFN-α和拉米夫定連用組更明顯的HBV抑制作用。該研究為以IFN-α為基礎(chǔ)的新型抗HBV