冬棗采后病害拮抗菌的篩選、發(fā)酵及活性物質(zhì)研究.pdf

1、本文以冬棗病害研究中常見的病原菌細(xì)交鏈格孢、多隔鐮孢霉和串珠霉為靶標(biāo)，從森林和菜園土壤中篩選防治三種病原菌的拮抗菌。通過測(cè)定對(duì)不同病原菌的拮抗能力，確定拮抗菌的抑菌譜，從中篩選具有研究和開發(fā)價(jià)值的拮抗菌研究。對(duì)具有較好拮抗作用和較寬抑菌譜的拮抗菌B26確定其分類學(xué)地位;通過正交試驗(yàn)和單因子實(shí)驗(yàn)，研究B26產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的最優(yōu)條件;并進(jìn)一步研究拮抗菌粗蛋白對(duì)溫度、酸堿度、紫外線照射、有機(jī)溶劑、蛋白酶的穩(wěn)定性，結(jié)果如下:
　　從土壤中分

2、離篩選出的11株對(duì)細(xì)交鏈格孢、多隔鐮孢霉和串珠霉具有較好抑制作用的拮抗菌。平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:B26的抑菌效果最顯著，對(duì)細(xì)交鏈格孢的平均抑菌圈半徑為15.8 mm，抑制率達(dá)78.8％;對(duì)多隔鐮孢霉和串珠霉的平均抑菌圈半徑分別為14.3 mm和12.8 mm，抑制率分別為71.3％和63.8％，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。通過觀察在PDA培養(yǎng)基上生長的形態(tài)學(xué)特征、結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)以及PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果，鑒定B26為枯草芽孢桿菌(Bacillu

3、s subtilis)。
　　通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基成分及用量進(jìn)行優(yōu)化，單因子實(shí)驗(yàn)對(duì)B26產(chǎn)生活性物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行選擇。B26在種子培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后接入不同成分的發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得產(chǎn)生拮抗效果最好的培養(yǎng)基成分的用量是:蛋白胨25 g，淀粉40 g，氯化鈉1.5 g，硫酸銨0.8 g，磷酸氫二鉀1.5 g;產(chǎn)生活性物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵條件為:種子菌齡24 h，接種量5％，初始pH7，裝液量20％，吐溫80用量0.5％，發(fā)酵溫度為30℃，

4、轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵時(shí)間為60 h，獲得B26菌株發(fā)酵液對(duì)多隔鐮孢霉的抑制直徑為26mm，大于其他條件培養(yǎng)獲得的拮抗菌直徑。
　　枯草芽孢桿菌B26發(fā)酵液在4℃，經(jīng)8000rpm，離心20 min后，過0.45μm微孔濾膜后，用70％的硫酸銨沉淀，透析后獲得仍具有拮抗細(xì)交鏈格孢、多隔鐮孢霉和串珠霉活性的無菌粗蛋白。進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)粗蛋白對(duì)溫度、酸堿度、紫外線照射、有機(jī)溶劑和蛋白酶處理的穩(wěn)定性，結(jié)果表明:B26的粗蛋白經(jīng)100℃

5、，20 min處理后，仍是常溫處理下抑菌直徑的78.2％，對(duì)高溫具有一定的耐受性;但經(jīng)121℃，20 min處理后，B26粗蛋白完全失去活性;粗蛋白在pH3-pH10范圍內(nèi)都具有抑菌活性，具有較寬的pH適應(yīng)范圍，但在pH為7時(shí)抑菌能力最高，所以應(yīng)注意B26抑菌蛋白的純化應(yīng)在偏中性的條件下進(jìn)行;粗蛋白對(duì)紫外線照射有部分敏感性，B26的抑菌粗蛋白經(jīng)距離40 cm，20W紫外燈照射80 min后，抑菌活性是對(duì)照的78.1％;有機(jī)溶劑對(duì)枯草芽孢

6、桿菌B26的抑菌粗蛋白的抑菌活性影響很小，經(jīng)過乙醚，甲醇，氯仿，和丙酮有機(jī)溶劑處理過的粗蛋白的抑菌活性分別為對(duì)照的96.4％、85.7％、82.1％、81.5％;B26的抑菌粗蛋白對(duì)三種蛋白酶具有部分敏感性，B26的抑菌粗蛋白經(jīng)過蛋白酶K處理后，拮抗直徑活性為15.2 mm，為對(duì)照的76.7％，經(jīng)過胰蛋白酶處理的拮抗直徑為16.2 mm，是未處理的81.8％，而經(jīng)過胃蛋白酶處理過的，拮抗直徑為16.3 mm，抑制率是未處理的83.3％。