乳腺癌異常鞘糖脂的表達(dá)及其功能的研究.pdf

1、本文對乳腺癌異常鞘糖脂的表達(dá)及其功能進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一章：乳腺癌患者組織樣本中中性鞘糖脂F(xiàn)uc-ɑ1,2 LacCer的表達(dá)。
　　目的：本課題研究乳腺癌患者癌組織中主要中性鞘糖脂的表達(dá)情況,并與成對的癌旁組織表達(dá)的中性鞘糖脂作對比,尋找在乳腺癌中異常表達(dá)的鞘糖脂。進(jìn)而探討其與乳腺癌的相關(guān)性和生物學(xué)功能。
　　方法：⑴采取有機(jī)溶劑超聲波提取的方法提取乳腺癌患者癌組織和對應(yīng)的癌旁組織樣本中的總鞘糖

2、脂,通過Sephadex A-25柱分離得到中、酸性鞘糖脂。⑵將分離得到的中性鞘糖脂經(jīng)過甲基化修飾反應(yīng)后進(jìn)行質(zhì)譜(ESI-LIT-MS)分析。對所得甲基化的中性鞘糖脂進(jìn)行一級質(zhì)譜(MS1)和多級質(zhì)譜(MSn)定性分析,確定各主要中性鞘糖脂的種類及具體結(jié)構(gòu),對比癌組織與對應(yīng)的癌旁組織尋找異常表達(dá)的鞘糖脂。⑶將結(jié)構(gòu)初步確定的異常鞘糖脂與標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行對比分析;將甲基化的中性鞘糖脂進(jìn)行液相-質(zhì)譜分析(LC-MS);將癌組織中性鞘糖脂經(jīng)相

3、關(guān)糖基酶(ɑ1,2 fucosidase)處理后質(zhì)譜分析。綜合三方面結(jié)果確定異常表達(dá)的鞘糖脂的結(jié)構(gòu)。⑷將主要中性鞘糖脂和異常表達(dá)鞘糖脂在所有的癌組織和對應(yīng)癌旁組織中的相對含量進(jìn)行分析比較;對異常表達(dá)鞘糖脂進(jìn)行前離子掃描質(zhì)譜含量分析,對比分析癌組織和對應(yīng)癌旁組織前離子掃描結(jié)果;將乳腺癌組織樣本中表達(dá)異常鞘糖脂在一級質(zhì)譜圖上的信噪比(SNR)與癌旁組織、白血病骨髓樣本和肝癌組織樣本分析比較;將異常表達(dá)的鞘糖脂進(jìn)行ROC分析確定其臨床診斷意義

4、;對不同分子分型的乳腺癌異常表達(dá)的鞘糖脂含量進(jìn)行比較分析。綜合以上分析結(jié)果確定異常表達(dá)鞘糖脂與乳腺癌的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果：①經(jīng)過一級和多級質(zhì)譜鑒定,確定乳腺癌癌組織和癌旁組織樣本中的主要中性鞘糖脂為 GlcCer, LacCer, globotrihexosylceramide(Gb3), globotetraglycosylceramide(Gb4)。癌組織中性鞘糖脂一級質(zhì)譜圖中的峰1184是Fucosyl-Lactoceram

5、ide(Fuc-ɑ1,2 LacCer)。另外,前人研究的乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物Globo-H(Fucosyl-Gb4)也在乳腺癌癌組織樣本中檢測到。②對主要中性鞘糖脂的相對含量比較得出:GlcCer和Gb3在癌旁組織中表達(dá)量較高,LacCer, Globo-H和Fuc-ɑ1,2 LacCer在癌組織中高表達(dá)。③SNR分析得出:與白血病和肝癌相比,Fuc-ɑ1,2 LacCer特異性地表達(dá)在乳腺癌組織中。ROC分析得出:Fuc-ɑ1,2 La

6、cCer作為一個臨床診斷指標(biāo)具有一定的靈敏性和特異性。
　　結(jié)論：Fuc-ɑ1,2 LacCer在乳腺癌組織中顯著高表達(dá)且具有特異性;Fuc-ɑ1,2 LacCer作為診斷指標(biāo)具有一定的臨床意義。
　　第二章：乳腺癌細(xì)胞系中鞘糖脂F(xiàn)uc-ɑ1,2 LacCer及其功能的研究。
　　目的：觀察 Fuc-ɑ1,2 LacCer在多種乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況,研究Fuc-ɑ1,2 LacCer及相關(guān)生物合成酶含量的變化對乳腺

7、癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,探討Fuc-ɑ1,2 LacCer及相關(guān)生物合成酶在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)意義。
　　方法：⑴對比多種人乳腺癌細(xì)胞系、人白血病細(xì)胞系、人肝癌細(xì)胞系及人外周血單核細(xì)胞中該鞘糖脂的表達(dá)情況。⑵通過RT-PCR及Realtime PCR檢測乳腺癌細(xì)胞系中Fuc-ɑ1,2 LacCer相關(guān)合成酶(巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)情況。篩選出巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1(FUT1)高表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞系作為后續(xù)功能實驗的工具細(xì)胞系。⑶通過

8、Western Blot方法檢測乳腺癌組織樣本中巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT1)表達(dá)情況。⑷采用RNA干擾技術(shù)(RNAi),對巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶高表達(dá)的細(xì)胞系進(jìn)行基因沉默;構(gòu)建表達(dá)FUT1的質(zhì)粒(pEGFPN1-FUT1),對巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶低表達(dá)的細(xì)胞系進(jìn)行基因過表達(dá)操作。對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行鞘糖脂分析,并對細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：①對多種不同腫瘤細(xì)胞系及人正常細(xì)胞Fuc-ɑ1,2 LacCer相對含量比較分析,得出Fuc-ɑ1,

9、2 LacCer在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)水平明顯高于其他細(xì)胞。②FUT1在MDA-MB-157和MDA-MB-453中表達(dá)量較高,在MDA-MB-231和 MCF-7中表達(dá)量較低。選取 MDA-MB-453和 MCF-7分別作為 FUT1基因沉默和過表達(dá)的工具細(xì)胞系。③與相應(yīng)的癌旁組織相比,FUT1在乳腺癌癌組織中表達(dá)量較高。④過表達(dá)FUT1后,MCF-7中Fuc-ɑ1,2 LacCer表達(dá)量顯著上升,遷移能力有所增強(qiáng)。
　　結(jié)論：F