MicroRNA在乳腺癌血清中的異常表達(dá)及mir-205功能的初步研究.pdf

1、背景:MircoRNAs(miRNAs)是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA,長(zhǎng)約20-24 nt,由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)、長(zhǎng)約70-80 nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成。miRNAs通過(guò)與其靶mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3'-UTR)互補(bǔ)結(jié)合,在翻譯水平上特異性抑制基因表達(dá),參與調(diào)控生物生長(zhǎng)和發(fā)育等許多復(fù)雜的生命過(guò)程。許多miRNAs的序列在起源甚遠(yuǎn)的物種之間相對(duì)保守,雖然這些

2、miRNAs的生物學(xué)功能目前還不十分清楚,但可以肯定的是它們有不同的表達(dá)模式,同時(shí)參與調(diào)節(jié)各種生理病理過(guò)程。異常的miRNAs表達(dá)與人類某些疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān),miRNAs被認(rèn)為是一組新的癌或抑癌基因,其表達(dá)具有特異性的腫瘤組織表達(dá)譜。循環(huán)核酸(CNA)是指存在于血液(血清或血漿)等體液中的細(xì)胞外游離DNA和RNA,與生理和病理狀態(tài)下的細(xì)胞代謝密切相關(guān),循環(huán)DNA和RNA水平的檢測(cè)及其在基因診斷等方面的應(yīng)用對(duì)于惡性腫瘤等疾

3、病的診斷和監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。近期人們?cè)谶M(jìn)行循環(huán)DNA、RNA分子檢測(cè)的同時(shí),在miRNAs方面也做了許多的工作,研究結(jié)果使得與腫瘤相關(guān)的核酸分子檢測(cè)這一領(lǐng)域變的更加讓人振奮。在血液中檢出腫瘤特異性的miRNAs并將其作為腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)于早期診斷腫瘤具有至關(guān)重要的意義。
　　 目的:
　　 1.建立起從血清中提取miRNA的方法,并檢測(cè)mir-21、mir-200c、mir-205在乳腺癌患者和健康對(duì)照人群血清

4、中的表達(dá)差異情況。
　　 2.了解mir-205對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7生長(zhǎng)和凋亡的影響。
　　 3.結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)miR-205的靶基因,為理解mir-205在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供依據(jù)。
　　 4.通過(guò)本研究,希望為乳腺癌的治療提供新的分子靶點(diǎn),為乳腺癌相關(guān)的診斷、預(yù)后標(biāo)志物研究提供新的內(nèi)容。
　　 方法：
　　 1.利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù),檢測(cè)并比較mir-21、mir

5、-200c、mir-205在乳腺癌病人和健康對(duì)照人群血清中的表達(dá)差異。
　　 2.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),上調(diào)mir-205在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)。利用熒光顯微鏡和熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)該方法的有效性。利用MTT法分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖活性的變化；流式細(xì)胞PI法分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)周期的變化；流式細(xì)胞儀FITC-AnnexinV/PI法分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡的變化。
　　 3.應(yīng)用不同的生物信息學(xué)方法對(duì)在乳腺癌細(xì)胞系MC

6、F-7中表達(dá)下調(diào)的miR-205的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法,對(duì)10例乳腺癌患者和3例健康對(duì)照人群的血清miRNA進(jìn)行了檢測(cè),成功從乳腺癌患者和健康對(duì)照人群的血清中提取出miRNA,發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組,乳腺癌患者血清中mir-200c的表達(dá)上調(diào),mir-205表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA mimics的實(shí)驗(yàn)技術(shù),其上調(diào)miRNA

7、的有效性得到證實(shí)。發(fā)現(xiàn)上調(diào)mir-205表達(dá)水平以后會(huì)降低乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖活性,增加細(xì)胞凋亡率,而對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。
　　 3.應(yīng)用miRBase、Pictar和Targetscan三大經(jīng)典靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-205進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),在至少兩個(gè)以上軟件預(yù)測(cè)出的靶基因有113個(gè)。其多個(gè)基因涉及細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡等眾多生物學(xué)過(guò)程,說(shuō)明miR-205在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中有著重要的生物學(xué)功能。

8、r>　　 結(jié)論：
　　 1.利用Trizol法和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法能夠成功提取乳腺癌患者和健康對(duì)照人群血清中的miRNA,并且發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清中mir-200c的表達(dá)上調(diào),mir-205表達(dá)下調(diào),有可能作為乳腺癌早期診斷的腫瘤分子標(biāo)志物。
　　 2.mir-205可降低乳腺癌細(xì)胞的增殖活性,增加凋亡率,但不影響細(xì)胞周期。
　　 3.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-205可能通過(guò)調(diào)控下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯引起