Rh-EPO干預(yù)早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷模型鼠的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：腦室周圍白質(zhì)損傷（periventricular white matter damage，PWMD）是早產(chǎn)兒腦損傷的主要神經(jīng)病理學(xué)形式，已成為早產(chǎn)兒腦癱、智力障礙等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主要原因之一，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前，早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，缺氧缺血是早產(chǎn)兒PWMD發(fā)生的兩個(gè)主要病因之一，而腦室周圍血管發(fā)育不完善是早產(chǎn)兒發(fā)生PWMD的重要解剖因素，目前針對(duì)早產(chǎn)兒PWMD)尚無有效的干預(yù)措施。所以尋找治療或預(yù)

2、防早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的方法、改善早產(chǎn)兒生存質(zhì)量已是目前迫切需要解決的問題之一。重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant humanerythropoietin，rh-EPO)多年來廣泛用于早產(chǎn)兒貧血的治療且取得較好的效果，隨著深入的研究發(fā)現(xiàn)EPO不僅具有造血功能，而且具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明外周靜脈或腹腔內(nèi)注射rh-EPO能通過血腦屏障直接在腦內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)rh-EPO與腦損傷的關(guān)系及機(jī)制研究主要集中于rh-

3、EPO對(duì)腦卒中及腦外傷等的神經(jīng)保護(hù)作用，與早產(chǎn)兒PWMD的關(guān)系的研究仍少，尤其是其中的機(jī)制目前不明確。因此，本研究通過建立缺氧缺血性PWMD新生鼠模型，并給缺氧缺血后的新生鼠腹腔內(nèi)注射一定劑量的rh-EPO，觀察rh-EPO對(duì)缺氧缺血的PWMD新生大鼠腦保護(hù)功能，并探討可能機(jī)制。該研究將為臨床治療早產(chǎn)兒PWMD提供一定的實(shí)驗(yàn)信息及依據(jù)，為今后進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒PWMD的防治提供新的思路和途徑。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)采用生后3日齡的新生大

4、鼠，除假手術(shù)（Sham）組外，其余各組大鼠乙醚麻醉后取頸部正中切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎，術(shù)畢放回原飼養(yǎng)環(huán)境中恢復(fù)2～3小時(shí)后置于恒溫密閉容器中，以2L·min-1的速度輸入6％O2、94％N2混合氣體，持續(xù)4小時(shí)。Sham組大鼠手術(shù)僅游離右側(cè)頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎，不進(jìn)行缺氧通氣。藥物干預(yù)組(HI-EPO)大鼠于缺氧后1小時(shí)內(nèi)給予腹腔注射(5U/g)的rh-EPO。缺氧缺血(hypoxia-ischemia，HI)組和Sham組大鼠給予腹

5、腔注射相同劑量的無菌生理鹽水。第一部分:整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中觀察大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育狀況，術(shù)后11天(P14)天斷頭取腦行HE染色觀察腦組織病理改變，生后(postnatal day，P)30天動(dòng)物行為檢測(cè)（懸吊實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、拒俘反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、圓筒實(shí)驗(yàn)）和P90天學(xué)習(xí)記憶檢測(cè)（三臂迷宮實(shí)驗(yàn)）。每小組完成實(shí)驗(yàn)保證6只。第二部分:分別于術(shù)后2天(P5)、術(shù)后5天(P7)、術(shù)后7天(P10)和術(shù)后11天(P14)斷頭取腦，一部分標(biāo)本用于免疫組化檢測(cè)EPO受

6、體(Eythropoietinreceptor，EPOR)和攜氧蛋白神經(jīng)珠蛋白(Neuroglobin，Ngb)，一部分標(biāo)本用于Western Blotting方法檢測(cè)EPOR蛋白，另一部分用于Real-time PCR方法檢測(cè)Ngb。每小組完成實(shí)驗(yàn)保證6只。第三部分:分別于術(shù)后2天(P5)、術(shù)后5天(P7)、術(shù)后7天(P10)和術(shù)后11天(P14)斷頭取腦，一部分標(biāo)本用于免疫組化檢測(cè)血管生成細(xì)胞內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial pr

7、ogenitor cells，EPCs)，一部分標(biāo)本用于Western Blotting法檢測(cè)EPCs，另一部分用Real-time PCR方法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)、血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)、新生微動(dòng)脈標(biāo)志EphrinB2和微靜脈標(biāo)志EphB4。每小組完成實(shí)驗(yàn)保證6只。
　　結(jié)果：⑴Sham組幼鼠死亡率為2.50％;

8、HI組幼鼠死亡率為16.12％; HI-EPO組幼鼠死亡率為8.23％;三組間死亡率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.32，P＜0.05)。術(shù)前，各組大鼠體重差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.448，P=0.647)，自術(shù)后2天(P5)起HI組大鼠體重增長(zhǎng)幅度低于Sham組，兩組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);HI-EPO組大鼠在手術(shù)后初期體重增長(zhǎng)情況不良，從術(shù)后7天始體重增長(zhǎng)加快，體重高于HI組但略低于Sham組，而且與Sham組和HI組間

9、體重差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。⑵Sham組鼠雙側(cè)腦室大小相同，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)大小正常。HI組鼠右側(cè)腦室較對(duì)側(cè)明顯增大，腦室形狀不規(guī)則，腦室周圍組織疏松，細(xì)胞變性、水腫，部分可見內(nèi)囊部位空腔形成;HI-EPO組鼠腦室周圍白質(zhì)病變減輕。⑶懸吊實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、拒俘實(shí)驗(yàn)及三臂迷宮評(píng)分結(jié)果均顯示三組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，進(jìn)一步兩兩分析，HI組評(píng)分明顯低于Sham組(P＜0.05)，HI-EPO組評(píng)分改善高于HI組(P＜0.05)，且與

10、Sham組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。圓筒實(shí)驗(yàn)評(píng)分結(jié)果顯示HI組偏好右前足的頻率與Sham組間存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），HI-EPO組則有改善，但未恢復(fù)到正常，與前兩組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。⑷Sham組大鼠EPOR表達(dá)在一較低水平;大鼠缺氧缺血后腦內(nèi)EPOR在術(shù)后2天(P5)即明顯增多，術(shù)后4天(P7)則逐漸開始下降，但一直到術(shù)后11天(P14)仍保持在一較高水平，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與Sham組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

11、（P＜0.05）;HI-EPO組大鼠EPOR在術(shù)后2天(P5)較HI組及Sham組均增高且達(dá)到一高峰，與HI組及Sham比較增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但很快開始下降，在術(shù)后4天(P7)就降至HI組水平，術(shù)后7天(P10)和術(shù)后11天(P14)進(jìn)一步下降，與Sham組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與HI組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。⑸Sham組大鼠Ngb隨著日齡的增大而略微增加;大鼠HI后腦內(nèi)Ngb在術(shù)后2天(P5)即

12、開始增加，術(shù)后7天(P10)及11天(P14)未表現(xiàn)出進(jìn)一步增多，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)與Sham組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;HI-EPO組大鼠Ngb在術(shù)后2天(P5)至術(shù)后7天(P10)較HI組增高，且兩組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)后11天(P14) Ngb則下降，與HI組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與Sham組比較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。⑹Sham組CD34+細(xì)胞隨著日齡的增加而增加;HI后CD34+細(xì)胞較相同日齡Sha

13、m組大鼠初始增多（P5和P7），且兩組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但術(shù)后7天起(P10)開始下降，并少于相同日齡Sham組大鼠，兩組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);HI-EPO組大鼠CD34+細(xì)胞變化趨勢(shì)同缺氧缺血組，且較相同日齡缺氧缺血組鼠增多，各時(shí)間點(diǎn)兩組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)與Sham組間差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。⑺Sham組大鼠VEGF、Ang-1表達(dá)隨著日齡的增加而增加;大鼠HI

14、后腦內(nèi)VEGF水平在術(shù)后2天(P5)即開始增加，至術(shù)后7天(P10)達(dá)到高峰，然后下降，各時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)量均較Sham組增多;HI-EPO組大鼠術(shù)后2天(P5) VEGF、 Ang-1表達(dá)量即較缺氧缺血組大鼠開始增加，術(shù)后7天(P10)達(dá)高峰，術(shù)后11天(P14)又開始下降但仍高于缺血缺氧組，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與缺血缺氧組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。⑻Sham組大鼠EphrinB2及EphB4表達(dá)均隨著日齡的增加而增加，各時(shí)間點(diǎn)E

15、phrinB2/EphB4比例接近0.5;大鼠缺氧缺血后腦內(nèi)EphrinB2及EphB4在術(shù)后2天(P5)未見增加，EphrinB2/EphB4為0.49，與Sham組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但自術(shù)后4天(P7) EphrinB2及EphB4迅速增加，與Sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)后7天(P10)開始則下降，但EphrinB2表達(dá)較EphB4多，EphrinB2/EphB4為0.56; HI-EPO組

16、大鼠術(shù)后2天(P5) EphrinB2及EphB4表達(dá)較HI組大鼠明顯增加（P＜0.05），術(shù)后4天(P7)達(dá)高峰然后開始下降，但仍高于缺血缺氧組，且EphrinB2表達(dá)較EphB4多。
　　結(jié)論：①缺氧缺血后腦組織有內(nèi)源性修復(fù)反應(yīng)，表現(xiàn)為腦室周圍白質(zhì)EPOR表達(dá)增加，攜氧蛋白Ngb呈現(xiàn)持續(xù)上升表達(dá)，并有血管新生反應(yīng)。②Rh-EPO對(duì)PWMD起到了保護(hù)作用，rh-EPO干預(yù)缺氧缺血腦白質(zhì)損傷鼠可以明顯減輕腦室周圍白質(zhì)區(qū)域的損傷，可