以阻抑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為策略的小分子化合物的發(fā)現(xiàn)及其對心衰大鼠保護作用的研究.pdf

1、目的:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)對于維持細(xì)胞內(nèi)生理活動穩(wěn)定有序進行具有重要的意義。心肌梗塞及心衰等許多疾病都與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。此研究的目的是(1)明確衣霉素(TM)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的時間依賴效應(yīng)。(2)篩選抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的小分子化合物。(3)在大鼠心肌細(xì)胞缺氧模型、大鼠急性心梗模型和大鼠慢性心衰模型3個模型中觀察小分子化合物PP1-14是否具有保護作用。(4)明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因PERK的敲除是否對心衰大鼠心功能有影響。
　　方法:(1)

2、將原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞隨機分為5組，1μM衣霉素分別培養(yǎng)1h，3h，6h，12h和24h，另設(shè)不加衣霉素為對照，提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA用于轉(zhuǎn)錄組測序。(2)ATF6是證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否誘發(fā)的核轉(zhuǎn)位因子。將穩(wěn)定表達(dá)ATF6-GFP融合蛋白的U2OS細(xì)胞模型隨機分為對照組、1μM衣霉素誘導(dǎo)組及衣霉素誘導(dǎo)前給藥組（分別給予待篩選的80個化合物），采用高內(nèi)涵技術(shù)監(jiān)測ATF6的核轉(zhuǎn)位。(3)將大鼠心肌細(xì)胞隨機分為對照組、缺氧組(缺氧24h)、缺氧

3、并給予PP1-14（提前30min給予）共培養(yǎng)組，通過CCK8，ATP等試劑盒檢測細(xì)胞活力，高內(nèi)涵及透射電鏡觀察細(xì)胞骨架及細(xì)胞形態(tài);將急性心梗大鼠隨機分為溶劑對照組、salubrinal組、PP1-14組和metoprolol組，在構(gòu)建急性心梗模型前3天每天給藥1次，另設(shè)正常對照大鼠組，通過TTC染色測量心梗面積，檢測血清中肌鈣蛋白T(c-TNT)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)，C反應(yīng)蛋白(CRP)的活力，TUNEL及western-b

4、lot測量大鼠心室組織的凋亡量及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子的表達(dá)水平;將心衰大鼠隨機分為溶劑對照組、salubrinal組、PP1-14組和captopril組，持續(xù)飼養(yǎng)動物8周每隔一天給藥1次，另設(shè)正常對照大鼠組，應(yīng)用超聲心動圖和血流動力學(xué)評價心臟的結(jié)構(gòu)及功能，計算心室指數(shù)，壓力負(fù)荷下的壓力容積斜率，檢測血液中腦鈉肽(BNP)和房鈉肽(ANP)的表達(dá)水平，應(yīng)用電鏡及TUNEL分別觀察心肌結(jié)構(gòu)、檢測細(xì)胞凋亡。提取細(xì)胞或心肌組織的總RNA用于轉(zhuǎn)錄組測

5、序。(4)構(gòu)建Si-PERK的心肌細(xì)胞并構(gòu)建PERK-KO的大鼠心衰模型，分別通過ATP檢測細(xì)胞活力并血流動力學(xué)評價心功能、計算心室指數(shù)。
　　結(jié)果:(1)TM在3h，6h，12h和24h分別誘導(dǎo)7，10，11，13內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的基因上調(diào)，除去已知Hspa5，Hsp90b1，Calr，Ddit3，Atf4基因，新發(fā)現(xiàn)6個(Hyou1，Herpud1，Manf, Creld2，Sdf2ll，Slc3a2)表達(dá)顯著變化的基因。(2)

6、在初篩的80個化合物中共發(fā)現(xiàn)17個化合物能夠抑制TM引起的ATF6核轉(zhuǎn)位，復(fù)篩發(fā)現(xiàn)PP1-13、PP1-14、PP1-19濃度依賴的抑制ATF6核轉(zhuǎn)位。(3)PP1-14能夠增加由于缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率下降，減輕缺氧誘導(dǎo)的染色體皺縮及邊緣化，PP1-14引起的表達(dá)差異基因主要聚類于對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)和細(xì)胞周期兩方面;急性心梗模型大鼠中出現(xiàn)梗死面積增加，部分心肌細(xì)胞伴少量炎細(xì)胞浸潤，血清中CK-MB、c-TNT、CRP水平上升，細(xì)胞凋

7、亡增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)增加，預(yù)防性給予PP1-14，以上各指標(biāo)均有明顯改善，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)量下調(diào)，被PP1-14下調(diào)的基因大部分聚類于代謝過程，氧化還原過程及免疫反應(yīng);大鼠慢性心衰模型上出現(xiàn)心室腔擴大、心肌變薄、心體指數(shù)變大，血清中BNP、ANP升高，凋亡蛋白表達(dá)量升高，心室做功(SW)、每搏輸出量(CO)、心輸出量(SV)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、壓力變化最大速率(dp/dtmax)、容積變化最大速率(dv/dtmax)均有

8、所下降，結(jié)扎下腔靜脈后顯示代表心肌收縮功能最大斜率(Dmax)下降，PP1-14治療組的各項指標(biāo)均有所改善。PP1-14下調(diào)的表達(dá)差異基因最多聚類于吞噬體。(4) Si-PERK的心肌細(xì)胞上藥物的保護作用消失，PERK-KO純合大鼠出現(xiàn)胚胎期致死，PERK-KO雜合組大鼠心功能各指標(biāo)不及野生組，PERK-KO雜合心衰大鼠中藥物的保護作用不及野生心衰大鼠。
　　結(jié)論:(1)TM從3h開始引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并新發(fā)現(xiàn)Hyou1，Her