低氧微環(huán)境促進(jìn)OM-MSCs增殖及向多巴胺能神經(jīng)元分化的研究.pdf

1、目的:
　　研究低氧微環(huán)境是否能促進(jìn)嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(OM-MSCs)增殖和低氧微環(huán)境下利用嗅鞘細(xì)胞(OECs)上清液誘導(dǎo)OM-MSCs向多巴胺能神經(jīng)元分化及其相關(guān)的機(jī)制。
　　方法:
　　1.OM-MSCs和OECs培養(yǎng)與鑒定:分離培養(yǎng)OM-MSCs和OECs，應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)、Western Blot及免疫熒光方法對兩種細(xì)胞分別進(jìn)行鑒定。
　　2.OM-MSCs在低氧微環(huán)境下增殖:實(shí)驗(yàn)將含10％FBS培養(yǎng)基培

2、養(yǎng)的OM-MSCs分成三組:3％O2+YC-1（HIF-1α抑制劑）組、3％O2組、21％O2組（常氧組），共同培養(yǎng)72h后先對細(xì)胞核進(jìn)行免疫熒光染色、細(xì)胞流式檢測細(xì)胞增殖及凋亡情況，再應(yīng)用Western blot方法檢測各組增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)的情況。
　　3.OM-MSCs在低氧微環(huán)境下用OECs上清液誘導(dǎo)其分化:實(shí)驗(yàn)將OM-MSCs分為另外三組:3％O2+YC-1+OECs上清誘導(dǎo)組（低氧A組）、3％O2+OE

3、Cs上清誘導(dǎo)組（低氧B組）及21％O2+OECs上清誘導(dǎo)組（常氧對照組），用免疫熒光檢測分化后的多巴胺能神經(jīng)元，用Q-PCR及Western blot分別檢測各組mRNA及蛋白表達(dá)情況，最后用膜片鉗檢測分化的神經(jīng)元離子通道開放情況及ELISA檢測分化后細(xì)胞上清中多巴胺的含量。
　　結(jié)果:
　　1.OM-MSCs和OECs培養(yǎng)與鑒定:分離培養(yǎng)出了OM-MSCs和OECs，并應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測出OM-MSCs的純度達(dá)99％;對培

4、養(yǎng)的OECs用免疫熒光進(jìn)行鑒定，能表達(dá)OECs標(biāo)記物P75，又經(jīng)Western Blot對OECs進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定顯示:GFAP和P75均有表達(dá)。
　　2.OM-MSCs在低氧微環(huán)境下增殖及凋亡檢測結(jié)果顯示:3％O2組比21％O2組的增值系數(shù)(PI)大，且兩組間的細(xì)胞存活及凋亡比例無顯著差異;3％O2組OM-MSCs核染色明顯比其他兩組比例要高，且21％O2組的細(xì)胞核數(shù)量最少;Western blot檢測顯示3％O2組的PCNA蛋

5、白表達(dá)顯著增高，同樣21％O2組的表達(dá)最少。
　　3.OM-MSCs在低氧微環(huán)境下用OECs上清液誘導(dǎo)分化檢測結(jié)果顯示:低氧B組OM-MSCs經(jīng)OECs誘導(dǎo)后免疫熒光βⅢ-tubulin表達(dá)最多，且表達(dá)TH神經(jīng)元（多巴胺能神經(jīng)元）;Q-PCR顯示低氧B組HIF-1α及下游靶基因TH表達(dá)明顯增高(P＜0.05);Western blot表明B組中βⅢ-tubulin和TH蛋白表達(dá)顯著增多，而GFAP蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05);

6、另外，誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)元經(jīng)膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)鉀離子電流，且ELISA檢測結(jié)果顯示低氧B組中分泌的多巴胺濃度顯著增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　低氧微環(huán)境能促進(jìn)OM-MSCs的增殖且對其細(xì)胞活性無影響;低氧微環(huán)境下培養(yǎng)的OM-MSCs經(jīng)OECs上清液誘導(dǎo)后能顯著提高其向神經(jīng)元分化的比例及向多巴胺能神經(jīng)元分化的比例，明顯降低了向膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力，且低氧微環(huán)境下分化的細(xì)胞能分泌更高濃度的多巴胺，此過程與OM-MSCs內(nèi)HIF