Mnk2作為非小細胞肺癌的預后因子及其分子基礎.pdf

1、目的：
　　由于Mnk2(主要是Mnk2A)較Mnk1有更高的生物活性[15]，且在我們前期的實驗中發(fā)現，在腫瘤標本及肺癌細胞株中Mnk2有更高的表達水平，所以是近年來的研究熱點也是我們的研究重點。我們擬通過對石蠟切片，非小細胞肺癌細胞株以及移植瘤動物模型三個方面對Mnk2進行檢測，了解Mnk2在非小細胞肺癌中對預后的提示意義及其分子基礎。
　　第一章 Mnk2蛋白表達水平與患者術后生存率及臨床病理特征的關系
　　方法

2、:
　　收集2006年10月至2009年6月經廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院診斷的367例非小細胞肺癌病例的組織標本及其中117例癌旁正常肺組織。所有標本經常規(guī)HE染色，選取合適區(qū)域制作組織芯片蠟塊，經免疫組化二步法檢測MNK2蛋白的表達水平，按細胞著色范圍及強度，根據中位數將MNK2表達水平分為低表達組及高表達組。
　　結果:
　　1.Mnk2蛋白表達定位于腫瘤細胞及支氣管上皮細胞的胞漿，相對于癌旁組織，肺癌組織中Mnk2

3、的蛋白表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(log-ranktest,t=-11.397, P＜0.001)。
　　2.在367例非小細胞肺癌組織中，Mnk2蛋白高表達的有220例，高表達率為59.5％(220/367)?；颊叩?年總生存(OS)比率為45.74％，5年無病生存率(DFS)為43.83％。
　　3.Mnk2低表達組(n=147)和高表達組(n=220)的OS比率分別為60.39％和36.01％，兩組有顯著性差

4、異(log-rank test，X2=16.382，P＜0.001);DFS比率分別為57.26％和35.04％，兩組有顯著性差異(log-rank test，X2=16.982，P＜0.001)。
　　4.在早中期病例中（Ⅰ+Ⅱ期），Mnk2表達水平與病人預后有顯著相關性，Mnk2低表達組(n=102)和高表達組(n=131)的5年生存率分別為67.43％和51.54％，兩組有顯著性差異（log-rank test，X2=5.1

5、23，P=0.024）;5年無病生存率分別為66.30％和50.42％，兩組有顯著性差異（log-rank test，X2=5.058，P=0.025，P=0.025）。
　　結論:
　　1.Mnk2在非小細胞肺癌細胞組織中高表達，Mnk2蛋白定位于腫瘤細胞及支氣管上皮細胞的胞漿。
　　2.367例非小細胞肺癌患者Mnk2高表達組的生存率明顯低于低表達組;
　　3.臨床分期Ⅰ-Ⅱ期（早，中期）及Ⅲ-Ⅳ期（中，晚期

6、）非小細胞肺癌中Mnk2的表達水平與患者預后顯著相關;
　　4.肺腺癌中Mnk2的表達水平與患者預后顯著相關;
　　5.Mnk2高表達和N分期分別是非小細胞肺癌預后不良的獨立指標之一;
　　6.Mnk2的表達水平與N分期有顯著相關性，而與年齡、性別、臨床分期、組織類型、吸煙及T分期沒有相關性。
　　7.MNK2與eIF4E、P-eIF4E的蛋白表達具有正性相關。提示MNK2在MAPK通路中可能通過eIF4E及磷酸

7、化eIF4E起作用。
　　第二章 MNK2在非小細胞肺癌細胞系中的表達及沉默后體外細胞功能實驗
　　方法:
　　1.選擇對數生長期的人非小細胞肺癌細胞株(A549、NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、NCI-H1650、SPC-A-1)以及正常支氣管上皮細胞株16HBE，采用熒光定量PCR方法檢測各細胞株中Mnk2的表達水平;
　　2.Mnk2基因沉默采用化學合成的siRNA序列，序列為:se

8、nse5'UCGUCAAGAUCAUUGAGAATT--3'及anti-sense5'-UUCUCAAUGAUCUUGACGGTT-3'，轉染A549,NCI-H460及NCI-H1975細胞株;
　　3.使用Mnk2-siRNA和Negative control進行細胞體外功能實驗，包括:CCK細胞增殖實驗，平板克隆形成實驗以及Transwell小室體外遷移實驗;
　　結果:
　　1.在非小細胞肺癌細胞株(A549、

9、NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、SPC-A-1、NCI-H1650)及正常支氣管上皮細胞株(16HBE)中，NCI-H1975的Mnk2表達水平最高。應用兩獨立樣本t檢驗表明與16HBE相比，Mnk2-mRNA在非小細胞肺癌細胞株NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、A549及SPC-A-1中高表達(P＜0.05，Independent-Samples t test)。單因素方差分析方差齊性檢(

10、LSD)顯示MNK2在非小細胞肺癌細胞株及正常支氣管上皮細胞株中的表達有顯著差異(P*＜0.001，F*值=43.494，)。
　　2.免疫熒光檢測非小細胞肺癌細胞株(A549、H1975、H460、SPC-A-1、H1650)及正常支氣管上皮細胞株(16HBE)中Mnk2的蛋白表達水平，結果顯示Mnk2在H1975、H460、A549三個細胞株中表達上調。而相對于16HBE，在SPC-A-1、H1650細胞中的表達降低。

11、　　3.免疫印跡檢測非小細胞肺癌細胞株(A549、H1975、H460、SPC-A-1、H1299、H1650)及正常支氣管上皮細胞株(16HBE)中Mnk2的蛋白表達水平，結果顯示Mnk2在H1975、H460、A549、H1299四個細胞株中表達上調。而相對于16HBE，在SPC-A-1、H1650細胞中的表達下調。
　　4.采用熒光定量RT-PCR檢測A549細胞中Mnk2-siRNA組及Negative control組中

12、Mnk2的表達水平顯示:Mnk2在Mnk2-siRNA組中的表達水平明顯低于Negative control組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-13.742，P＜0.001，Independent-Samples t test);
　　結論:
　　1.在肺癌細胞株中，Mnk2的表達水平明顯高于正常支氣管上皮細胞，提示 Mnk2是肺癌信號通路中被激活的一類蛋白;
　　2.在轉染了Mnk2-siRNA的肺癌細胞株中，細胞增殖，細

13、胞克隆能力及體外遷移能力受到抑制，提示Mnk2是惡性腫瘤發(fā)生，發(fā)展，侵襲和轉移的重要因素之一。
　　第三章 Mnk2沉默后的動物實驗
　　方法:
　　1.通過慢病毒轉染A549及NCI-H460細胞的方法構建Mnk2-shRNA-A549及Mnk2-shRNA-H460;
　　2.選用處于對數生長期的A549和NCI-H460細胞，轉染慢病毒Mnk2-shRNA或negative control后使用DMEM培養(yǎng)

14、基稀釋到濃度為2×106/ml及3×106/ml;
　　3.將細胞分別注射于裸鼠脅腹側，4天后開始觀察腫瘤大小，每3天記錄一次，在適當時候處死裸鼠，剔出瘤體并稱重，行石蠟包埋切片并行HE染色，顯微鏡下觀察。
　　4.將細胞經尾靜脈注入裸鼠體內，接種3天后觀察裸鼠狀態(tài)，30天時處死裸鼠，取肝臟組織觀察其表面成瘤數目。
　　結果:
　　1.在注射的A549細胞株的各7只裸鼠中， NC組的所有裸鼠均成瘤，Mnk2-sh

15、RNA組只有6只(85.7％)裸鼠成瘤，成瘤時間在第10天后。兩組成瘤速度統(tǒng)計學有顯著差異P＜0.05，Independent-Samples t test)。處死裸鼠后，A549細胞株Mnk2-shRNA組瘤重0.05±0.049g，小于NC組瘤重(0.149±0.722g)(t=-2.976,P=0.012,two-independent t test);
　　2.在注射的NCI-H460細胞株的各7只裸鼠中，NC組的所有裸鼠

16、均成瘤，Mnk2-shRNA組只有6只(85.7％)裸鼠成瘤，成瘤時間在第7天后。Mnk2-shRNA組的成瘤速度比NC組成瘤速度慢，但兩組的成瘤速度之間除了第7天統(tǒng)計學有顯著差異(P=0.031，Independent-Samples t test)之外，之后的腫瘤體積無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，Independent-Samples t test)。處死裸鼠后，NCI-H460細胞株Mnk2-shRNA組瘤重0.217±0.152g

17、，小于NC組瘤重(0.343±0.078g)，但統(tǒng)計學沒意義(t=-1.947，P=0.075，Independent-Samples ttest);
　　3.在注射A549細胞株的各5只裸鼠中，Mnk2-shRNA組的所有裸鼠肝臟轉移瘤數（3±1個）比NC組的肝臟轉移瘤數（10±3個）明顯減少，兩組成瘤速度統(tǒng)計學有顯著差異(t=-5.259，P=0.001，Independent-Samples t test);
　　結論