Il-1β誘導人角膜上皮細胞產生Il-6和Il-8的分子機制及地塞米松對其抑制作用的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述：
　　第一部分 IL-1β誘導人角膜上皮細胞產生IL-6和IL-8的分子機制
　　IL-1β是一種促炎細胞因子，它在調控固有免疫反應和適應性免疫應答中均發(fā)揮了重要作用。研究表明在多種角膜炎癥性疾病患者的淚液和角膜組織中，IL-1β水平有明顯升高（和正常對照比較），如單皰病毒性角膜炎、細菌性角膜炎、角膜熱/化學燒傷、胬肉和角膜移植排斥等。此外，IL-1β可以誘導角膜上皮細胞，角膜基質細胞和角膜內

2、皮細胞產生多種炎癥因子，包括IL-6，IL-8，TNFα，COX2，iNOS，MCP-1，MIP-3和ICAM-1等，提示IL-1β廣泛地參與了角膜的炎癥過程。IL-6和IL-8是兩種重要的炎癥效應分子。IL-6是多功能的細胞因子，它同時具有促炎和抗炎作用。IL-8是白細胞的趨化因子和活化因子。正常情況下，角膜組織和淚液中幾乎檢測不到IL-6和IL-8的表達。然而，多種角膜炎癥性疾病患者的淚液和角膜組織中檢測到了IL-6和IL-8的高表

3、達（和正常對照比較），提示這兩種炎癥細胞因子在角膜炎癥中也扮演了重要的角色。多種促炎細胞因子、細菌和病毒產物等都能夠快速而顯著地誘導IL-6和IL-8的表達，其中IL-1β是其主要的誘導因子。已知MAPKs信號通路和促炎轉錄因子NF-κB在介導IL-1β誘導產生IL-6和IL-8中均有著非常重要的作用。既往研究表明IL-1β可以誘導體外培養(yǎng)的SV40轉化的人角膜上皮細胞(SV40-HCECs)及原代培養(yǎng)的HCECs表達IL-6和IL-8

4、，無論是 mRNA水平還是蛋白質水平均有顯著升高，然而IL-1β調控HCECs產生IL-6和IL-8的分子機制尚未清楚。
　　目的:
　　本實驗組旨在揭示IL-1β誘導HCECs產生IL-6和IL-8的分子機制，主要以三條經典的MAPKs信號通路，即ERK，p38和JNK信號通路，以及轉錄因子NF-κB為分子靶點，研究其在IL-1β誘導HCECs產生IL-6和IL-8中的作用以及IL-1β活化的三條MAPKs信號通路與IL-

5、1β誘導的NF-κB亞基p65入核和IL-1β上調的NF-κB轉錄活性之間的內在聯(lián)系。
　　方法:
　　通過實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)技術檢測給予和不給予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平，以及抑制三條MAPKs信號通路和轉錄因子NF-κB后，再給予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8mRNA水平。采用Western blot技術檢測給予和不給予IL-1β刺激的三條經典的MAPKs信

6、號通路及NF-κB抑制因子IκBα的磷酸化水平。通過細胞免疫熒光染色技術檢測給予和不給予IL-1β刺激的HCECs NF-κB亞基p65的亞細胞定位以及分別單獨抑制三條MAPKs信號通路后再給予IL-1β刺激的HCECs p65的亞細胞定位;行雙熒光素酶報告基因檢測技術檢測給予和不給予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的轉錄活性及分別單獨抑制三條MAPKs信號通路后再給予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的轉錄活性。
　　

7、結果:
　　IL-1β顯著上調HCECs IL-6和IL-8mRNA水平，呈時間依賴性和濃度依賴性。IL-1β上調了HCECs中三個經典MAPKs的磷酸化水平;分別單獨抑制p38和JNK信號通路或兩兩聯(lián)合抑制ERK1/2，p38和JNK信號通路都可以抑制IL-1β對HCECs IL-6mRNA水平的上調;而分別單獨抑制或兩兩聯(lián)合抑制ERK1/2，p38和JNK信號通路都可以抑制IL-1β對HCECs IL-8mRNA水平的上調。I

8、L-1β上調了 HCECs NF-κB抑制因子IκBα的磷酸化水平;IL-1β可以誘導p65入核并上調NF-κB的轉錄活性。抑制NF-κB的活化可以顯著抑制IL-1β對HCECs IL-6和IL-8mRNA水平的上調。分別單獨抑制ERK1/2，p38和JNK信號通路不能抑制IL-1β對HCECs p65的誘導入核。單獨抑制p38信號通路能部分抑制IL-1β對HCECsNF-κB轉錄活性的上調，而分別單獨抑制ERK1/2和JNK信號通路沒

9、有抑制IL-1β對HCECs NF-κB轉錄活性的上調。
　　結論:
　　1.p38，JNK和NF-κB信號通路介導了IL-1β誘導HCECs產生IL-6;
　　2.ERK1/2，p38，JNK和NF-κB信號通路介導了IL-1β誘導HCECs產生IL-8;
　　3.p38信號通路介導了IL-1β對HCECs NF-κB轉錄活性的上調。
　　第二部分 地塞米松抑制IL-1β誘導人角膜上皮細胞產生IL-6和I

10、L-8的作用機制
　　地塞米松是一種合成的長效糖皮質激素，因具有顯著的的抗炎作用而被廣泛地用于治療多種免疫性和炎癥性疾病。在眼科，地塞米松也被廣泛地用于治療多種炎癥性眼病并取得了很好的療效，如葡萄膜炎、增值性玻璃體視網膜病變、視網膜下新生血管和Mooren's角膜潰瘍等。地塞米松的抗炎機制非常復雜，主要有兩方面:抑制炎癥基因表達和誘導抗炎蛋白基因表達(如MKP-1)。地塞米松抑制炎癥基因表達的調控方式還可分為基因依賴和非基因依賴兩

11、種，其中基因依賴的方式又可進一步分為直接和間接兩種。地塞米松基因依賴的間接抑炎作用主要是通過誘導表達多種負調控因子從而抑制多條信號通路的活化和轉錄因子的活性來實現(xiàn)的。例如，地塞米松可以通過誘導IκBα的表達來抑制NF-κB活性進而抑制炎癥基因的表達;地塞米松還可以通過誘導絲裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的表達來抑制多條MAPKs信號通路的活化進而抑制炎癥基因的表達。MKP-1是三條經典的MAPKs信號通路的負調控因子，通過去

12、磷酸化活化的MAPKs使其失活，在調控MAPKs信號通路的活化強度和持續(xù)時間上有著重要作用。已知三條MAPKs既可以從轉錄水平正向調控炎癥因子的誘導表達，也可以通過轉錄后修飾增強多種炎癥因子mRNA的穩(wěn)定性，提示地塞米松抑制的MAPKs信號通路可以間接地從轉錄水平和轉錄后水平負向調控炎癥因子的誘導表達。既往研究顯示地塞米松可以抑制IL-1β誘導人角膜上皮細胞和人角膜成纖維細胞產生多種細胞因子和趨化因子(如IL-6和IL-8)，但是其具體

13、的分子機制還不清楚。基于前述的理論依據，再結合第一部分實驗中已經證實的三條經典的MAPKs信號通路參與調控了IL-1β誘導HCECs產生IL-6和IL-8mRNA，我們推測地塞米松抑制IL-1β誘導HCECs產生IL-6和IL-8部分是通過誘導HCECs表達MKP-1產生進而抑制MAPKs信號通路介導的。
　　目的:
　　探索地塞米松抑制IL-1β誘導HCECs產生IL-6和IL-8是否通過誘導MKP-1產生進而抑制MAPK

14、s信號通路介導的。
　　方法:
　　通過qPCR技術檢測地塞米松對IL-1β誘導HCECs產生IL-6和IL-8 mRNA的影響及地塞米松對HCECs MKP-1mRNA表達的影響;采用Western blot技術檢測地塞米松對IL-1β誘導的HCECs三條MAPKs信號通路的影響。結果:
　　地塞米松部分抑制了IL-1β對HCECs IL-6和IL-8mRNA水平的上調。地塞米松能夠抑制IL-1β對HCECs ERK