Il-1β誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生Il-6和Il-8的分子機(jī)制及地塞米松對(duì)其抑制作用的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 IL-1β誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8的分子機(jī)制
　　IL-1β是一種促炎細(xì)胞因子，它在調(diào)控固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均發(fā)揮了重要作用。研究表明在多種角膜炎癥性疾病患者的淚液和角膜組織中，IL-1β水平有明顯升高（和正常對(duì)照比較），如單皰病毒性角膜炎、細(xì)菌性角膜炎、角膜熱/化學(xué)燒傷、胬肉和角膜移植排斥等。此外，IL-1β可以誘導(dǎo)角膜上皮細(xì)胞，角膜基質(zhì)細(xì)胞和角膜內(nèi)

2、皮細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子，包括IL-6，IL-8，TNFα，COX2，iNOS，MCP-1，MIP-3和ICAM-1等，提示IL-1β廣泛地參與了角膜的炎癥過(guò)程。IL-6和IL-8是兩種重要的炎癥效應(yīng)分子。IL-6是多功能的細(xì)胞因子，它同時(shí)具有促炎和抗炎作用。IL-8是白細(xì)胞的趨化因子和活化因子。正常情況下，角膜組織和淚液中幾乎檢測(cè)不到IL-6和IL-8的表達(dá)。然而，多種角膜炎癥性疾病患者的淚液和角膜組織中檢測(cè)到了IL-6和IL-8的高表

3、達(dá)（和正常對(duì)照比較），提示這兩種炎癥細(xì)胞因子在角膜炎癥中也扮演了重要的角色。多種促炎細(xì)胞因子、細(xì)菌和病毒產(chǎn)物等都能夠快速而顯著地誘導(dǎo)IL-6和IL-8的表達(dá)，其中IL-1β是其主要的誘導(dǎo)因子。已知MAPKs信號(hào)通路和促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在介導(dǎo)IL-1β誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6和IL-8中均有著非常重要的作用。既往研究表明IL-1β可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的SV40轉(zhuǎn)化的人角膜上皮細(xì)胞(SV40-HCECs)及原代培養(yǎng)的HCECs表達(dá)IL-6和IL-8

4、，無(wú)論是 mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平均有顯著升高，然而IL-1β調(diào)控HCECs產(chǎn)生IL-6和IL-8的分子機(jī)制尚未清楚。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)組旨在揭示IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-6和IL-8的分子機(jī)制，主要以三條經(jīng)典的MAPKs信號(hào)通路，即ERK，p38和JNK信號(hào)通路，以及轉(zhuǎn)錄因子NF-κB為分子靶點(diǎn)，研究其在IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-6和IL-8中的作用以及IL-1β活化的三條MAPKs信號(hào)通路與IL-

5、1β誘導(dǎo)的NF-κB亞基p65入核和IL-1β上調(diào)的NF-κB轉(zhuǎn)錄活性之間的內(nèi)在聯(lián)系。
　　方法:
　　通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)技術(shù)檢測(cè)給予和不給予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平，以及抑制三條MAPKs信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB后，再給予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8mRNA水平。采用Western blot技術(shù)檢測(cè)給予和不給予IL-1β刺激的三條經(jīng)典的MAPKs信

6、號(hào)通路及NF-κB抑制因子IκBα的磷酸化水平。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)給予和不給予IL-1β刺激的HCECs NF-κB亞基p65的亞細(xì)胞定位以及分別單獨(dú)抑制三條MAPKs信號(hào)通路后再給予IL-1β刺激的HCECs p65的亞細(xì)胞定位;行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)給予和不給予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性及分別單獨(dú)抑制三條MAPKs信號(hào)通路后再給予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　

7、結(jié)果:
　　IL-1β顯著上調(diào)HCECs IL-6和IL-8mRNA水平，呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。IL-1β上調(diào)了HCECs中三個(gè)經(jīng)典MAPKs的磷酸化水平;分別單獨(dú)抑制p38和JNK信號(hào)通路或兩兩聯(lián)合抑制ERK1/2，p38和JNK信號(hào)通路都可以抑制IL-1β對(duì)HCECs IL-6mRNA水平的上調(diào);而分別單獨(dú)抑制或兩兩聯(lián)合抑制ERK1/2，p38和JNK信號(hào)通路都可以抑制IL-1β對(duì)HCECs IL-8mRNA水平的上調(diào)。I

8、L-1β上調(diào)了 HCECs NF-κB抑制因子IκBα的磷酸化水平;IL-1β可以誘導(dǎo)p65入核并上調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。抑制NF-κB的活化可以顯著抑制IL-1β對(duì)HCECs IL-6和IL-8mRNA水平的上調(diào)。分別單獨(dú)抑制ERK1/2，p38和JNK信號(hào)通路不能抑制IL-1β對(duì)HCECs p65的誘導(dǎo)入核。單獨(dú)抑制p38信號(hào)通路能部分抑制IL-1β對(duì)HCECsNF-κB轉(zhuǎn)錄活性的上調(diào)，而分別單獨(dú)抑制ERK1/2和JNK信號(hào)通路沒(méi)

9、有抑制IL-1β對(duì)HCECs NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.p38，JNK和NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)了IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-6;
　　2.ERK1/2，p38，JNK和NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)了IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-8;
　　3.p38信號(hào)通路介導(dǎo)了IL-1β對(duì)HCECs NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的上調(diào)。
　　第二部分 地塞米松抑制IL-1β誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和I

10、L-8的作用機(jī)制
　　地塞米松是一種合成的長(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素，因具有顯著的的抗炎作用而被廣泛地用于治療多種免疫性和炎癥性疾病。在眼科，地塞米松也被廣泛地用于治療多種炎癥性眼病并取得了很好的療效，如葡萄膜炎、增值性玻璃體視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜下新生血管和Mooren's角膜潰瘍等。地塞米松的抗炎機(jī)制非常復(fù)雜，主要有兩方面:抑制炎癥基因表達(dá)和誘導(dǎo)抗炎蛋白基因表達(dá)(如MKP-1)。地塞米松抑制炎癥基因表達(dá)的調(diào)控方式還可分為基因依賴和非基因依賴兩

11、種，其中基因依賴的方式又可進(jìn)一步分為直接和間接兩種。地塞米松基因依賴的間接抑炎作用主要是通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)多種負(fù)調(diào)控因子從而抑制多條信號(hào)通路的活化和轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。例如，地塞米松可以通過(guò)誘導(dǎo)IκBα的表達(dá)來(lái)抑制NF-κB活性進(jìn)而抑制炎癥基因的表達(dá);地塞米松還可以通過(guò)誘導(dǎo)絲裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的表達(dá)來(lái)抑制多條MAPKs信號(hào)通路的活化進(jìn)而抑制炎癥基因的表達(dá)。MKP-1是三條經(jīng)典的MAPKs信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，通過(guò)去

12、磷酸化活化的MAPKs使其失活，在調(diào)控MAPKs信號(hào)通路的活化強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間上有著重要作用。已知三條MAPKs既可以從轉(zhuǎn)錄水平正向調(diào)控炎癥因子的誘導(dǎo)表達(dá)，也可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾增強(qiáng)多種炎癥因子mRNA的穩(wěn)定性，提示地塞米松抑制的MAPKs信號(hào)通路可以間接地從轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控炎癥因子的誘導(dǎo)表達(dá)。既往研究顯示地塞米松可以抑制IL-1β誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞和人角膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子(如IL-6和IL-8)，但是其具體

13、的分子機(jī)制還不清楚。基于前述的理論依據(jù)，再結(jié)合第一部分實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)的三條經(jīng)典的MAPKs信號(hào)通路參與調(diào)控了IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-6和IL-8mRNA，我們推測(cè)地塞米松抑制IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-6和IL-8部分是通過(guò)誘導(dǎo)HCECs表達(dá)MKP-1產(chǎn)生進(jìn)而抑制MAPKs信號(hào)通路介導(dǎo)的。
　　目的:
　　探索地塞米松抑制IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-6和IL-8是否通過(guò)誘導(dǎo)MKP-1產(chǎn)生進(jìn)而抑制MAPK

14、s信號(hào)通路介導(dǎo)的。
　　方法:
　　通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)地塞米松對(duì)IL-1β誘導(dǎo)HCECs產(chǎn)生IL-6和IL-8 mRNA的影響及地塞米松對(duì)HCECs MKP-1mRNA表達(dá)的影響;采用Western blot技術(shù)檢測(cè)地塞米松對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的HCECs三條MAPKs信號(hào)通路的影響。結(jié)果:
　　地塞米松部分抑制了IL-1β對(duì)HCECs IL-6和IL-8mRNA水平的上調(diào)。地塞米松能夠抑制IL-1β對(duì)HCECs ERK