Lin28B-LeT-7調(diào)控環(huán)影響胃癌進(jìn)展的實驗研究.pdf

1、目前臨床所見消化道惡性腫瘤中，胃癌是發(fā)病率最高的，同時胃癌死亡率住居全球第三位。胃癌在我國發(fā)病率位居前列，近年胃癌死亡率依然位于前五位。隨著外科技術(shù)、化療方式、放療以及分子靶向治療的進(jìn)展，近年來胃癌預(yù)后得到了改善。但胃癌的長期預(yù)后仍然不佳，進(jìn)展期胃癌的5年生存率低于40％。
　　Lin28B蛋白是Lin28的同源物，是最初發(fā)現(xiàn)于線蟲中的一個高度保守的小RNA結(jié)合蛋白。Lin28B結(jié)構(gòu)包括一對能夠結(jié)合RNA的獨特的RNA聯(lián)結(jié)模體-冷

2、休克結(jié)構(gòu)域和一對反向的CCHC鋅指結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)Lin28是在胚胎和胚胎干細(xì)胞高表達(dá)，正常成人組織中低表達(dá)，這表明Lin28可能在胚胎發(fā)育過程中的對細(xì)胞增殖和分化起關(guān)鍵作用。Lin28B促進(jìn)惡變，其表達(dá)與多種類型的腫瘤，包括肝癌，腎母細(xì)胞瘤，卵巢癌和生殖細(xì)胞腫瘤的晚期階段相關(guān)。它在各種腫瘤如肝細(xì)胞癌和結(jié)腸直腸癌高表達(dá)。Lin28的過度表達(dá)已被證明促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。Lin28高表達(dá)是肝癌預(yù)后不良因素，Lin28B顯著與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

3、有關(guān)。
　　小分子(microRNA，miRNA)是一種小分子非編碼RNA，約22個核苷酸長，其通過反義機制抑制靶信使核糖核酸。近來越來越多的證據(jù)表明，miRNA作為腫瘤抑制或致癌者參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miRNA Let-7最初在線蟲中被發(fā)現(xiàn)，作為異時性基因促進(jìn)線蟲幼蟲期到成蟲的過渡。對Let-7的進(jìn)一步研究表明其在細(xì)胞增殖，分化，凋亡，代謝均有功能。研究表明Let-7的水平在人腫瘤中降低，而且其缺失或下調(diào)能夠與腫瘤侵襲性和臨床

4、預(yù)后差相光。另外有體內(nèi)研究表明Let-7的異常表達(dá)能夠減少化療抵抗和癌細(xì)胞侵襲，抑制人肺癌生長。
　　在分子水平上，Lin28是Let-7生物合成的抑制劑。Lin28B通過作用于Let-7的成熟的過程和細(xì)胞分化來調(diào)節(jié)Let-7家族的成員。已有研究報道Lin28作為調(diào)節(jié)器可結(jié)合Let-7的前體miRNA阻止胚胎干細(xì)胞的成熟。Let-7的這種特殊的功能在從人成纖維細(xì)胞形成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem

5、 cells，iPS cells)的過程中可提高細(xì)胞的形成效率。一些研究也已經(jīng)表明Lin28和Let-7之間的關(guān)聯(lián)作用，特別是細(xì)胞分化和增殖的過程中。
　　然而既往對胃癌的研究中，Lin28B/Let-7調(diào)控環(huán)在胃癌中是否存在并沒有確切研究結(jié)果，同時Lin28B/Let-7調(diào)控環(huán)對于胃癌具體進(jìn)展的影響也無明確的結(jié)論。本研究的目的是通過以下實驗，明確Lin28B/Let-7調(diào)控環(huán)在胃癌中存在，并進(jìn)一步通過體內(nèi)和體外研究探索其對胃癌發(fā)

6、展的影響。
　　目的:1.分別在胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中，檢測Lin28B以及Let-7的表達(dá)，分析其是否存在相關(guān)性;2.明確Lin28B/Let-7調(diào)控環(huán)在胃癌細(xì)胞中的存在;3.在胃癌細(xì)胞中過表達(dá)Let-7，觀察其對胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響;4.觀察胃癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Let-7對化療藥物5-氟尿嘧啶敏感性的變化;5.觀察過表達(dá)Let-7對裸鼠人胃癌皮下移植瘤生長的影響。
　　方法:1.通過RT-PCR和Western Bl

7、ot方法檢測胃癌腫瘤組織樣本及正常對照組織中Lin28B表達(dá)水平的差異;通過qRT-PCR方法檢測胃癌腫瘤組織樣本及正常對照組織中Let-7表達(dá)水平的差異;通過利用流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)分選胃癌細(xì)胞系BGC-823中CD133+/CD44+的細(xì)胞，檢測其中Lin28B和Let-7表達(dá)水平。
　　2.采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法，將Let-7轉(zhuǎn)染入BGC-823細(xì)胞中，然后檢測Lin28B表達(dá)水平。
　　3.

8、采用CCK-8法檢測過表達(dá)Let-7對BGC-823細(xì)胞增殖的影響。
　　4.采用CCK-8法檢測BGC-823細(xì)胞和轉(zhuǎn)染Let-7后BGC-823細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的藥物敏感性。
　　5.細(xì)胞成球?qū)嶒炘u價Let-7對BGC-823細(xì)胞分化能力的影響。
　　6.裸鼠成瘤實驗評價過表達(dá)Let-7對BGC-823細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　結(jié)果:1.Lin28B和Let-7在胃癌組織和癌旁正常組織中均存在;Let-

9、7在胃癌腫瘤組織中表達(dá)水平較癌旁正常組織顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);Lin28B在胃癌腫瘤組織中表達(dá)水平較癌旁正常組織顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.在的胃癌細(xì)胞系BGC-823發(fā)現(xiàn)Lin28B和Let-7均有表達(dá)，且CD133+/CD44+和CD133-/CD44-細(xì)胞中其表達(dá)有差異。
　　3.Lin28B和Let-7在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　4.在胃癌細(xì)胞系BGC-82

10、3轉(zhuǎn)染Let-7后，Lin28B的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　5.采用CCK-8法檢測過表達(dá)Let-7對BGC-823細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明過表達(dá)Let-7抑制BGC-823細(xì)胞增殖。
　　6.采用CCK-8法檢測藥物細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示過表達(dá)Let-7提高胃癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。
　　7.采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期顯示過表達(dá)Let-7并不改變BGC-823細(xì)胞周期。
　　8.超低吸附培養(yǎng)板細(xì)胞成

11、球?qū)嶒烇@示過表達(dá)Let-7降低BGC-823細(xì)胞威球能力。
　　9.裸鼠成瘤實驗顯示過表達(dá)Let-7顯著抑制BGC-823細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力。
　　結(jié)論:1.研究發(fā)現(xiàn)Lin28B和Let-7在胃癌細(xì)胞系有表達(dá)，在胃癌組織中也均有表達(dá)。Lin28B在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常的胃粘膜組織;Let-7在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于正常的胃粘膜組織。同時發(fā)現(xiàn)Lin28B和Let-7在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　2.體外研究發(fā)