CCN3對TGF-β1誘導的人腎小球系膜細胞胞外基質代謝的影響.pdf

1、腎小球硬化是慢性腎臟病進展的重要機制，也是終末期腎衰形成的主要原因，其特征是腎小球系膜細胞增生、細胞外基質大量沉積。近年來研究證實，腎母細胞瘤過度表達蛋白(Nephroblastoma overexpressed gene，CCN3/NOV)具有抑制纖維化的作用，但是其對腎小球硬化的影響尚不清楚。
　　目的:
　　本實驗旨在探討CCN3對腎小球系膜細胞胞外基質沉積的影響，為防治腎小球硬化和CKD進展提供新的思路。
　　

2、方法:
　　1、體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞（Human Mesangial cell，HMC），使用不同濃度(0、0.5、1.0、2.0 ng/ml)轉化生長因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）作用HMC24h，并且使用終濃度為2.0ng/ml的TGF-β1干預HMC不同時間(0、12、24、48 hour)，運用Western blot技術檢測細胞CCN3蛋白表達情況。
　　2

3、、在無血清培養(yǎng)基中加入TGF-β1(2.0ng/ml)1小時前，外源性給予不同濃度(5ng/ml，50ng/ml，500ng/ml)CCN3干預人腎小球系膜細胞或建立高表達CCN3質粒瞬時轉染人腎小球系膜細胞，具體分組如下:空白對照組、TGF-β1干預組(2ng/ml)、CCN3（5ng/ml）+TGF-β1干預組、CCN3(50ng/ml)+ TGF-β1干預組、CCN3(500ng/ml)+ TGF-β1干預組、TGF-β1+CCN

4、3質粒干預組、TGF-β1+空白質粒干預組、CCN3質粒干預組、空白質粒干預組。RealTime-PCR技術檢測各組纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、Ⅰ型膠原蛋白(TypeⅠ collagen，COLI)、基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9，MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(Tissue in

5、hibitor ofmetalloproteinases-1，TIMP-1)mRNA表達情況，Western blot技術檢測各組FN、COLI、MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達水平，激光共聚焦顯微鏡技術檢測各組FN、COLI的表達情況。
　　結果:
　　(1)TGF-β1可抑制HMC CCN3蛋白的表達，呈濃度和時間依賴性（終濃度為2.0ng/ml作用24小時抑制作用最強）(P＜0.05)。
　　(2)與

6、正常對照組相比，TGF-β1組細胞FN及COLI蛋白及mRNA表達明顯增加(P＜0.05)，TGF-β1刺激前1小時給予不同濃度CCN3重組蛋白干預后可顯著抑制TGF-β1誘導的上述指標的表達(P＜0.05)。其中，在CCN3濃度為5ng/ml時即可顯著抑制COLI及FN的表達，抑制效應呈濃度依賴性;
　　(3)與正常對照組相比，TGF-β1組MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA水平顯著降低(P＜0.05)，TIMP-1蛋白及mR

7、NA水平顯著升高(P＜0.05)，TGF-β1刺激前1小時給予不同濃度CCN3重組蛋白干預后，MMP-2、MMP-9蛋白及mRNA表達均較TGF-β1干預組顯著上調而TIMP-1蛋白及mRNA表達較TGF-β1干預組顯著下調(P＜0.05)。
　　(4)與TGF-β1組相比，內源性轉染pcDNA-3.1(+)-CCN3質粒+TGF-β1干預組FN、COL1及TIMP-1蛋白及mRNA的表達均顯著降低，MMP-2、MMP-9蛋白及m