E3連接酶TRIM26通過泛素化降解核內(nèi)的IRF3負(fù)向調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒免疫反應(yīng).pdf

1、目的:
　　TRIM26作為TRIM家族中重要的一員，之前在天然免疫中的研究是非常少的，鑒于TRIM家族的相似結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，考慮TRIM26作為一種E3連接酶是否會在天然免疫應(yīng)答中起到泛素化修飾的作用，是否參與到TLR，RLR，NLR以及DNA信號通路介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生之中，并對機(jī)體的抗病毒免疫起到調(diào)控作用，同時驗證TRIM26作用的靶分子以及是通過何種形式的泛素化形式起到相應(yīng)的作用。
　　方法:
　　1.病毒感染對T

2、RIM26的調(diào)控
　　1.1 病毒感染對TRIM26表達(dá)的影響
　　取小鼠的各種組織，利用Western Blotting方法，檢測小鼠各組織中的TRIM26蛋白的表達(dá)。用LPS和poly(I∶C)刺激，以及SeV感染小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞，利用Western Blotting方法檢測TRIM26在各種刺激以及感染情況下的表達(dá)變化。
　　1.2 TRIM26在細(xì)胞內(nèi)的定位
　　構(gòu)建帶GFP熒光標(biāo)簽的TRIM26過表

3、達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，利用免疫熒光技術(shù)觀察TRIM26在細(xì)胞內(nèi)的定位，同時，用LPS刺激或是SeV感染之后，免疫熒光檢測一下TRIM26定位的變化。
　　2.TRIM26負(fù)向調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒免疫
　　2.1 TRIM26過表達(dá)對IFN-β產(chǎn)生的影響
　　在RAW264.7細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體以及IFN-β報告基因載體，培養(yǎng)過夜，之后用LPS和poly(I∶C)刺激轉(zhuǎn)染過的RAW26

4、4.7細(xì)胞系，報告基因檢測IFN-β活性水平。同樣方法，利用報告基因方法在穩(wěn)定表達(dá)TLR3,TLR4受體的HEK293細(xì)胞中檢測TRIM26對IFN-β報告基因的活性水平。
　　2.2 TRIM26干擾之后對IFN-β產(chǎn)生的影響
　　取小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞，利用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法，將TRIM26相應(yīng)的干擾RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)巨噬細(xì)胞，用LPS和poly(I∶C)刺激，以及SeV感染，ISD轉(zhuǎn)染相應(yīng)的時間，ELISA方法檢測IF

5、N-β的產(chǎn)生變化。
　　2.3 TRIM26的抗病毒影響
　　將TRIM26過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，然后用VSV進(jìn)行感染，RT-PCR檢測IFN-β的產(chǎn)生變化以及VSV的mRNA水平的變化。將TRIM26過表達(dá)載體或是相應(yīng)的小干擾RNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系，24小時后用VSV感染Hela細(xì)胞8小時，收集細(xì)胞上清，利用病毒空斑試驗檢測病毒的數(shù)量。
　　3.TRIM26靶分子的尋找
　　3.1 TRIM26對IRF

6、3報告基因的影響
　　將TRIM26過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)TLR3,TLR4的HEK293細(xì)胞之中，以及轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞之中，然后用相應(yīng)的配體進(jìn)行刺激，分別用LPS和poly(I∶C)刺激TLR4,TLR3細(xì)胞系，以及SeV感染，ISD轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，利用報告基因方法檢測TRIM26對IRF3報告基因的活性水平的影響。
　　3.2 TRIM26對接頭分子的影響
　　在HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體以及

7、相應(yīng)的接頭分子:TRIF,MAVS，STING+cGAS和TBK1,提取細(xì)胞蛋白，用Western Blotting方法檢測TRIM26對IRF3磷酸化的影響。同樣，轉(zhuǎn)染TRIM26小干擾后，再用LPS刺激以及SeV感染之后，Western Blotting方法檢測TRIM26干擾之后對IRF3磷酸化的影響。為了進(jìn)一步確定TRIM26的靶分子，在HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體以及IRF3報告基因載體，報告基因方法檢測TR

8、IM26對各個接頭分子TRIF, RIG-Ⅰ，MAVS，TBK1和IRF3引起的IRF3報告基因活性的影響，進(jìn)一步明確TRIM26作用的靶分子。
　　結(jié)果：
　　1.病毒感染對TRIM26的調(diào)控
　　1.1 病毒感染誘導(dǎo)TRIM26的表達(dá)
　　取小鼠各組織，利用Western Blotting方法，檢測小鼠各組織中的TRIM26蛋白的表達(dá)，檢測發(fā)現(xiàn)在小鼠的肺臟，胸腺，肝臟，脾臟，小腸以及腦組織之中，TRIM26都

9、有大量的表達(dá)，但是在心臟和腎臟之中表達(dá)較少。用LPS和poly(I∶C)刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞時，在4小時開始，TRIM26表達(dá)開始出現(xiàn)增加，12到16小時時表達(dá)達(dá)到高峰，在SeV感染小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞時，利用WesternBlotting方法檢測發(fā)現(xiàn)TRIM26的表達(dá)變化與LPS和poly(I∶C)刺激時相似。這說明TRIM26有可能參加到病毒感染引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之中。
　　1.2 病毒感染引起TRIM26的入核
　　為

10、了明確TRIM26在細(xì)胞內(nèi)的定位，我們構(gòu)建帶GFP熒光標(biāo)簽的TRIM26過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞，利用免疫熒光技術(shù)觀察TRIM26在細(xì)胞內(nèi)的定位，發(fā)現(xiàn)TRIM26在沒有刺激的情況下是定位在細(xì)胞質(zhì)中的。在細(xì)胞受到SeV, VSV感染8小時時，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)TRIM26出現(xiàn)明顯的入核現(xiàn)象，同時，用LPS刺激穩(wěn)定表達(dá)TLR4的HEK293細(xì)胞時，免疫熒光檢測同樣發(fā)現(xiàn)TRIM26出現(xiàn)明顯的核定位現(xiàn)象。綜上訴述情況說明TRIM26在病

11、毒感染時會出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核定位現(xiàn)象。
　　2.TRIM26負(fù)向調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒免疫
　　2.1 TRIM26抑制病毒感染引起的IFN-β的產(chǎn)生
　　為了驗證TRIM26在抗病毒免疫反應(yīng)中的作用，我們用報告基因的方法檢測TRIM26對眾多的PRRs引起的下游的IFN-β表達(dá)的影響。在RAW264.7細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染TRIM26過表達(dá)載體以及IFN-β報告基因載體，培養(yǎng)過夜，之后用LPS和poly(I∶C)刺激轉(zhuǎn)

12、染過的RAW264.7細(xì)胞系，報告基因檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體的RAW264.7細(xì)胞系的IFN-β報告基因活性明顯變?nèi)酢Ｍ瑯臃椒?，利用報告基因方法在穩(wěn)定表達(dá)TLR3,TLR4受體的HEK293細(xì)胞中檢測TRIM26對IFN-β報告基因的活性水平也是出現(xiàn)了明顯的下降。接下來，我們在HEK293以及Hela細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體以及IFN-β報告基因載體，轉(zhuǎn)染過夜之后，用SeV感染以及poly(I∶C)轉(zhuǎn)染進(jìn)行刺

13、激，轉(zhuǎn)染ISD以及poly(dA∶dT)之后，報告基因檢測發(fā)現(xiàn)TRIM26能明顯下調(diào)各種刺激引起的IFN-β的報告基因活性。
　　2.2 TRIM26干擾之后對IFN-β產(chǎn)生的影響
　　為了更加直接的研究TRIM26對于IFN-β產(chǎn)生的影響，我們設(shè)計了TRIM26的小干擾RNA進(jìn)行下面的實驗。取小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞，利用轉(zhuǎn)染小干擾RNA的方法，將TRIM26相應(yīng)的干擾RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36-48小時之后，用LPS和

14、poly(I∶C)刺激，以及SeV感染，ISD轉(zhuǎn)染分別6小時和12小時，ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)TRIM26被干擾掉之后，IFN-β的產(chǎn)生出現(xiàn)明顯的升高。這些結(jié)果說明TRIM26對病原微生物尤其是病毒感染之后引起的IFN-β的產(chǎn)生具有抑制作用。
　　2.3 TRIM26的抗病毒影響
　　為了更加直接的研究TRIM26對于機(jī)體抗病毒的影響，將TRIM26過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，然后用VSV進(jìn)行感染，RT-PCR檢測IFN-β

15、的產(chǎn)生變化以及VSV的mRNA水平的變化。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體的Hela細(xì)胞系，產(chǎn)生的IFN-β，相對比于轉(zhuǎn)染了空載體的Hela細(xì)胞系來說，IFN-β的表達(dá)明顯下降，同時VSV mRNA水平在轉(zhuǎn)染了TRIM26過表達(dá)載體的細(xì)胞系中，出現(xiàn)明顯的升高，說明了TRIM26對抗病毒作用具有負(fù)向調(diào)控作用。接下來，將TRIM26過表達(dá)載體或是相應(yīng)的小干擾RNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞系，24小時后用VSV感染Hela細(xì)胞8小時，收集細(xì)胞上清

16、，病毒空斑試驗檢測發(fā)現(xiàn)TRIM26過表達(dá)之后，VSV病毒空斑數(shù)量明顯增多，相似的情況，當(dāng)用TRIM26小干擾RNA之后，VSV病毒空斑數(shù)量出現(xiàn)相應(yīng)的較少，病毒空斑實驗說明了TRIM26對機(jī)體的抗病毒反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控作用。
　　結(jié)論：
　　1.首次揭示了TRIM26作為E3連接酶在天然免疫中的作用
　　TRIM26作為TRIM家族中的一員，其E3連接酶功能相對于其他家族成員來說，研究的不是很多，尤其是TRIM26在天然免疫

17、中的作用，更是知之甚少，在這里，我們首先研究了TRIM26在抗病毒天然免疫中的作用，無論是在TLR，RLR還是DNA信號通路中，我們都做了詳細(xì)的驗證與說明。我們的研究證實了TRIM26作為一種E3連接酶可以在天然免疫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　2.首次證實了TRIM26特異性的靶向作用于核內(nèi)的IRF3
　　IRF3作為機(jī)體重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，IRF3的活化需要磷酸化，二聚化以及核轉(zhuǎn)位，之前