參靈健骨膠囊基于代謝組學(xué)的抗骨質(zhì)疏松機制研究.pdf

1、隨著我國老年人口的增加，患有骨質(zhì)疏松癥的人口數(shù)也在逐步增加，研究治療骨質(zhì)疏松的藥物至關(guān)重要，也得到了人們的高度重視。參靈健骨膠囊是我們課題組擁有專利的一種治療骨質(zhì)疏松的中藥組合物，具有滋補肝腎，活血止痛之功效。本實驗通過維甲酸致大鼠骨質(zhì)疏松模型，對參靈健骨膠囊進行藥效學(xué)評價，并從代謝水平揭示其作用機制，為開發(fā)新藥提供理論依據(jù)。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：參靈健骨膠囊對維甲酸致骨質(zhì)疏松大鼠的藥效學(xué)研究。
　　目的：用維

2、甲酸灌胃大鼠建立骨質(zhì)疏松模型，從骨密度、生化檢測以及病理組織觀察三方面評價參靈健骨膠囊對骨質(zhì)疏松大鼠的藥效作用。
　　方法：⑴動物和分組：健康 SD大鼠60只，♂，280-300g。按體重隨機分為6組：正常對照組、模型對照組、參靈健骨膠囊低劑量組、參靈健骨膠囊中劑量組、參靈健骨膠囊高劑量組和陽性對照組。正常對照組灌胃羧甲基纖維素鈉，模型對照組灌胃維甲酸，各給藥組及陽性組上午灌胃維甲酸，下午給相應(yīng)受試物，連續(xù)四周。⑵骨密度：用異氟烷

3、氣體麻醉大鼠，分別于實驗0天、7天、14天、21天、28天用小動物成像儀五次測定大鼠股骨中段骨密度值。⑶生化檢測：實驗前各組大鼠禁食24h(自由飲水)，水合氯醛麻醉，并迅速腹主動脈取血，加入到EP管中，離心（3500r/min，10min），分離血清，測定大鼠血清中Ca、P、ALP含量。⑷病理組織檢查：實驗四周后處死大鼠，完整取出各組大鼠右側(cè)脛骨，浸泡于福爾馬林溶液中固定，骨脫鈣，然后HE染色，切片觀察。
　　結(jié)果：①組間比較，統(tǒng)

4、計實驗開始前第0天測定的各組大鼠骨密度值，數(shù)據(jù)之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.1），符合隨機分配原則。第7天骨密度值亦無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.1），說明藥物初始作用不明顯。統(tǒng)計第14天骨密度值，和正常組比較，模型組和各給藥組均下降（P<0.05）；和模型組相比，低劑量組、高劑量組和陽性組顯著升高（P<0.05），中劑量組骨密度亦升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.1）。統(tǒng)計第21天骨密度值，正常組、模型組和各給藥組無統(tǒng)計學(xué)差異（0.05

5、。統(tǒng)計第28天骨密度值，和正常組比較，模型組骨密度值顯著降低（P<0.01），低劑量組、高劑量組和陽性組無統(tǒng)計學(xué)差別（P>0.1），中劑量組下降（0.010.1）。模型組大鼠骨密度持續(xù)降低，統(tǒng)計結(jié)果

6、顯示，灌胃維甲酸第14天開始和第0天比有顯著性差異（P<0.01）。給藥組大鼠骨密度先呈現(xiàn)一定的下降趨勢，給藥后又有一定的回升：低劑量組、高劑量組和陽性組第7、14、21、28天骨密度值和第0天比均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.1）；中劑量組大鼠骨密度變化較明顯，第14天和第0天比較骨密度值顯著降低（P<0.01），第21、28天下降減?。≒<0.05）。②血鈣：維甲酸灌胃大鼠后，血清中鈣離子濃度變化明顯，模型組相對正常組明顯降低（P<0.01

7、）。給藥后，鈣離子濃度有所回升，但與正常對照組相比有差異（P<0.05）；與模型組比較回升較明顯，健骨低劑量組和陽性組有差異（ P<0.05），健骨中劑量組和健骨高劑量組有顯著性差異（P<0.01）。血磷：實驗大鼠血清磷含量變化顯著，模型組相對正常組明顯降低（P<0.01）；給藥后，各給藥組血清磷含量升高，與正常對照組相比，健骨低劑量組、中劑量組和陽性組無差異（P>0.05），健骨高劑量組升高不明顯（P<0.05）；與模型組比較，健骨高

8、劑量組和陽性組有提高，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05），健骨中劑量組明顯提高（P<0.05），健骨低劑量組有顯著性提高（P<0.01）。堿性磷酸酶：與正常對照組相比，模型組明顯升高（P<0.01）；健骨中劑量組、高劑量組和陽性組無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），健骨低劑量組有輕微升高（P<0.05）；與模型組相比，各給藥組ALP含量均下降，健骨低劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），健骨中劑量組、高劑量組和陽性組均有顯著性差異（P<0.01）。

9、血鈣、血磷、堿性磷酸酶檢測結(jié)果均表明維甲酸致大鼠骨吸收大于骨形成，給藥后各指標有向正常對照組回歸的趨勢。③病理組織結(jié)果顯示正常對照組大鼠脛骨骨髓細胞密集分布、無空曠區(qū)域，腔大小正常，骨皮質(zhì)致密、邊緣整齊；模型組骨髓腔擴大，有正常區(qū)域存在，骨質(zhì)空洞嚴重，說明骨質(zhì)疏松造模成功；給藥組骨質(zhì)空洞相對較小，且有類似成骨組織形成，骨髓腔和骨皮質(zhì)界限模糊，可能是藥物作用的結(jié)果。
　　結(jié)論：參靈健骨膠囊能使骨密度升高，調(diào)節(jié)血鈣、血磷及堿性磷酸酶含

10、量，使之趨于正常水平，使骨髓細胞密集分布、骨質(zhì)空洞減小，具有一定的抗骨質(zhì)疏松作用。
　　第二部分：參靈健骨膠囊抗骨質(zhì)疏松的代謝組學(xué)機制研究。
　　目的：基于代謝組學(xué)，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠的代謝特征開展研究，尋找差異性代謝產(chǎn)物，揭示參靈健骨膠囊抗骨質(zhì)疏松的作用機制。
　　方法：⑴血漿樣品：實驗前各組大鼠禁食24h(自由飲水)，水合氯醛麻醉，并迅速腹主動脈取血，血液加入到有肝素的 EP管中，離心（3

11、500r/min，10min），分離血漿，置-80℃凍存，備用。組織樣品：大鼠取血完畢，取睪丸、附睪分別于凍存管中，液氮速凍，轉(zhuǎn)移置-80℃凍存，備用。⑵血漿：4℃復(fù)溶，血與乙腈（1:3）渦旋沉淀蛋白，14000r/min，10min，低溫4℃離心，取上清加水稀釋，渦旋得樣品。組織：分別稱適量睪丸、附睪組織，加萃取液乙腈和甲醇（3:1），勻漿，混合，13000r/min，10min，低溫4℃離心，上清液通過0.22μm濾膜過濾，得待測樣

12、品。⑶利用AB SCIEX TripleTOFTM5600 System采集數(shù)據(jù)。⑷通過樣本的正、負離子檢測模式的Q-Triple5600 MS測定得原始數(shù)據(jù)，利用AB公司的markerview1.2.1代謝組學(xué)分析軟件對其進行峰識別、峰過濾、峰對齊，最終獲得包括質(zhì)荷比（M/Z）和保留時間（Retention time）及其峰面積的二維數(shù)據(jù)陣。將上述獲得的二維數(shù)據(jù)陣導(dǎo)入軟件 SIMCA-P進行了多變量統(tǒng)計分析。⑸利用傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析規(guī)律，

13、確定代謝物的準分子離子峰并通過人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫HMDL查找可能的代謝物。
　　結(jié)果：通過對血漿及組織代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的處理和分析，血漿中鑒定8個差異性代謝產(chǎn)物，分別為苯丙氨酸、色氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異己酸、甲羥戊酸、磷酸肌酸、2-甲基雌酮。睪丸中鑒定差9個異性代謝物，分別為組氨酸、高半胱氨酸、高胱氨酸、2-磷酸甘油酸、甲羥戊酸、嘌呤、核糖醇、去氧皮質(zhì)酮和葡萄糖。附睪中鑒定8個差異性代謝物，分別為亮氨酸、組氨酸、高胱氨酸、苯乙酰甘氨