芥子氣原型的體內(nèi)分析新方法及“脂庫蓄積”與內(nèi)源性生物標志物差異的發(fā)現(xiàn).pdf

1、芥子氣(Sulfur Mustard，美軍代號HD)是難防難治化學(xué)戰(zhàn)劑的代表及外軍重點研究的目標化學(xué)戰(zhàn)劑，是世界現(xiàn)存化學(xué)武器的主要填充劑，也是日軍在華遺棄化學(xué)武器的主要成份。其結(jié)構(gòu)簡單，容易合成，恐怖威脅巨大。因此，基于應(yīng)對化學(xué)戰(zhàn)、化學(xué)恐怖襲擊的迫切前提，以及我國所面臨的復(fù)雜周邊戰(zhàn)事環(huán)境，在目前尚無有效的預(yù)防和治療措施條件下，迫切需要通過新的研究手段來深入闡述芥子氣中毒機制。
　　芥子氣作為廣泛的烷基化試劑而引起多靶點多臟器中毒損

2、傷作用，但傳統(tǒng)毒理學(xué)研究大多數(shù)局限于關(guān)注孤立的某些通路或某一個基因、蛋白的變化，因此，迄今為止其具體的毒理作用機制并未完全闡明。本課題首先基于系統(tǒng)毒理學(xué)研究思路，冀希在整體層面上探索芥子氣的復(fù)雜毒理作用。側(cè)重于應(yīng)用整合代謝組學(xué)技術(shù)，從不同生物樣本層面研究體內(nèi)處置過程中代謝物組的動態(tài)變化趨勢，尋找發(fā)現(xiàn)芥子氣中毒相關(guān)的內(nèi)源性生物標志物，探討各種機制間的相互聯(lián)系和作用，以及不同機制間發(fā)揮作用的先后順序與重要程度，提出輔助臨床診斷指標和醫(yī)學(xué)干預(yù)

3、措施，以期對于芥子氣的干預(yù)和治療產(chǎn)生一定的指導(dǎo)作用。
　　芥子氣在體內(nèi)具有反應(yīng)活性高、代謝速度快等特點，對分析方法的穩(wěn)定性和靈敏度要求非常高，但經(jīng)典分析方法在分析生物樣本中芥子氣原型時存在瓶頸，如氣相色譜法分析芥子氣存在熱不穩(wěn)定，同位素示蹤法無法區(qū)分原型與代謝產(chǎn)物，基于膠體金的原子吸收法存在內(nèi)源性巰基化合物干擾等問題，導(dǎo)致目前芥子氣體內(nèi)處置數(shù)據(jù)的不確定性。本課題在建立高靈敏度和高穩(wěn)定性的芥子氣原型體內(nèi)分析新方法基礎(chǔ)上，將分析毒理學(xué)

4、研究思路應(yīng)用于芥子氣原型在體內(nèi)吸收、分布等處置過程的分析，深入且清晰地闡明芥子氣原型在體內(nèi)的代謝模式、途徑與機制等問題。進而準確把握芥子氣在體內(nèi)的留存方式和時相，對于發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵毒理作用的靶細胞及靶器官，指導(dǎo)臨床干預(yù)治療的位點以及有效時間窗等具有非常重要的意義。
　　具體研究結(jié)果如下：
　　(1)損傷內(nèi)源性生物標志物的發(fā)現(xiàn)
　　尿液樣本分析
　　結(jié)合反相液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（RPLC-MS）與親水作用色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HIL

5、IC-MS)技術(shù)，綜合運用多種譜圖解析手段共鑒定與芥子氣相關(guān)的內(nèi)源性生物標志物34個，主要有核酸類代謝產(chǎn)物，如胞嘧啶、脫氧胞苷、脫氧腺苷等;色氨酸及其代謝產(chǎn)物，如黃尿酸、犬尿喹啉酸、葡糖醛酸化吲哚乙酸等;苯丙氨酸及其代謝產(chǎn)物，如阿魏酸、馬尿酸等;能量代謝相關(guān)代謝產(chǎn)物，如檸檬酸、葡糖酸、膽汁酸鹽等;以及一些與食物消化相關(guān)的黃酮類化合物，如大豆素與葡糖醛酸化大豆素等。涉及到的體內(nèi)代謝途徑主要包括DNA的損傷修復(fù)代謝，炎癥相關(guān)氨基酸代謝，腸道

6、菌群失衡，糖、脂肪等能量物質(zhì)代謝，以及Ⅱ相酶誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化途徑（如葡萄糖醛酸化和硫酸酯化）等。
　　血漿樣本分析
　　綜合運用多種譜圖解析技術(shù)共鑒定與芥子氣相關(guān)的極性小分子內(nèi)源性生物標志物27個，主要有膽汁酸類代謝產(chǎn)物，如膽酸、脫氧膽酸、甘氨酸膽酸等;氨基酸及其代謝產(chǎn)物，如苯丙氨酸、色氨酸、苯乙醇硫酸鹽等;能量代謝相關(guān)代謝產(chǎn)物，如檸檬酸、尿酸等;以及磷脂類化合物，如溶血性磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿等。同時，應(yīng)用脂質(zhì)吸附填料特征提取

7、血漿中脂類成分，通過全信息串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)(MSE)，鑒定出163種脂類代謝產(chǎn)物，并針對這些脂類化合物進行了靶向脂質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與芥子氣代謝相關(guān)的甘油三酯亞型、甘油二酯以及磷脂類內(nèi)源性生物標志物。結(jié)合血液生化指標結(jié)果和芥子氣皮膚染毒大鼠血漿中代謝組（包括小分子極性代謝產(chǎn)物與脂類代謝產(chǎn)物）隨時間變化的軌跡，闡述了芥子氣與肝臟急性損傷的相關(guān)性和物質(zhì)基礎(chǔ)，以及與不飽和脂類代謝產(chǎn)物高度相關(guān)的脂質(zhì)過氧化過程。
　　組織樣本分析
　　

8、通過對不同臟器（包括肝、肺、脾、腦和胰腺）在中毒后的代謝輪廓軌跡的分析，探討了芥子氣作用于不同器官時所造成的代謝狀態(tài)改變的方向和效應(yīng)。結(jié)合肝臟組織極性代謝產(chǎn)物的代謝組學(xué)軌跡分析與非極性脂類代謝產(chǎn)物的非靶標脂質(zhì)組學(xué)分析，以及血液生化分析中指征肝功能損傷的轉(zhuǎn)氨酶指標變化趨勢等，發(fā)現(xiàn)芥子氣在6-12h的潛伏期內(nèi)就已造成肝臟功能的急性損傷，具體表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶的升高，膽汁酸的合成和轉(zhuǎn)運受阻，肝臟代謝酶體系的抑制，溶血性磷脂含量的升高等。肝臟組織實時

9、熒光定量PCR結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了膽汁酸代謝及轉(zhuǎn)運相關(guān)關(guān)鍵酶基因的RNA表達水平下調(diào)。
　　(2)芥子氣原型體內(nèi)分析新方法及“脂庫蓄積”
　　利用芥子氣的烷基化反應(yīng)活性，通過衍生化試劑硫代乙酸鉀(PTA)與其發(fā)生親核反應(yīng)，生成穩(wěn)定且兼具良好色譜和質(zhì)譜行為的衍生化產(chǎn)物雙乙酰硫基乙硫醚(BTAETE)，進而采用同位素稀釋法液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對衍生化產(chǎn)物進行檢測，首次實現(xiàn)了對復(fù)雜基質(zhì)樣品中芥子氣的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法(LC-MS/MS)

10、進行定性和定量分析。該LC-MS/MS分析方法的運行時間短、回收率高、精密度和重復(fù)性良好，尤其是靈敏度和穩(wěn)定性高于現(xiàn)行經(jīng)典檢測技術(shù)(乙腈溶液中的最低定量限達到0.1 ng/mL，而全血中的最低定量限達到0.5 ng/mL)，且衍生化方法簡便快捷，樣品制備與檢測分析可在1小時內(nèi)完成，能有效分離檢測復(fù)雜基質(zhì)樣品中芥子氣原型，成功應(yīng)用于揭示生物樣品中芥子氣原型存在的定量分析。
　　通過對芥子氣皮膚染毒大鼠體內(nèi)血液及不同組織中芥子氣原型分

11、子的代謝行為研究，結(jié)果顯示芥子氣透皮后迅速進入循環(huán)系統(tǒng)并隨血液分布到全身臟器，其脂肪組織中的含量要遠高于非脂肪臟器（至少15倍），經(jīng)計算脂肪組織中僅在芥子氣達峰時蓄積量就占實際染毒劑量的1.25％，出現(xiàn)了明顯的“脂庫蓄積”現(xiàn)象，且在較高濃度下能夠維持一定時間（消除半衰期為1.3-2 h），與現(xiàn)有體內(nèi)代謝數(shù)據(jù)相比，觀測分布與消除時相均有所延長;進一步通過毒代動力學(xué)分析表明芥子氣原型在脂肪組織中1-3h達到平均峰值，達峰后迅速消除，脂肪內(nèi)平

12、均駐留時間為2.5-5.3 h，同時其含量存在一定的染毒劑量相關(guān)性。目前還沒有見到針對脂肪組織中芥子氣的毒代動力學(xué)相關(guān)研究報道，本論文應(yīng)用建立的芥子氣原型體內(nèi)分析新方法首次發(fā)現(xiàn)并證明了“脂庫蓄積”，并且全面分析了芥子氣在生物體內(nèi)的代謝分布處置全過程。
　　綜上分析，芥子氣中毒存在非常明顯的時程效應(yīng)和復(fù)合效應(yīng)，在潛伏期主要以DNA的損傷修復(fù)、脂質(zhì)過氧化與肝臟急性損傷等為主;發(fā)展期主要表現(xiàn)為過度炎癥反應(yīng);恢復(fù)期則表現(xiàn)為能量反饋代謝。針