FAM46A，EBF1和PTPN22基因多態(tài)性與河南漢族肺結(jié)核相關(guān)性分析.pdf

1、研究背景和目的：
　　肺結(jié)核（Pulmonary tuberculosis，PTB）是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染而引起的一種傳染病，其感染率和致死率均較高，嚴(yán)重威脅了人類的健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球目前約有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，其中1/10的人發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核。WHO的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全球有22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，我國是其中之一，結(jié)核病死亡率在各種死因中位列第9。
　　肺結(jié)核的

2、發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，除了受病原體毒力和環(huán)境因素的影響外，其發(fā)生還與宿主遺傳基因有關(guān)。肺結(jié)核的遺傳易患性由多種基因決定，而且因種族和地域的差異有所區(qū)別，所以臨床上應(yīng)針對(duì)不同的群體制定預(yù)防、診斷和治療方案。因此，篩選不同地域和人群的肺結(jié)核易感基因，并探索其發(fā)病的分子機(jī)制，將為制定有針對(duì)性的預(yù)防、診斷和治療方案提供理論依據(jù)和參考數(shù)據(jù)。
　　近年來，隨著人類基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種基因與肺結(jié)核的易感性相關(guān)。
　　200

3、2年，Lagali,P.S等人首次發(fā)現(xiàn)位于染色體6q14.1的FAM46A基因，其編碼序列第2外顯子處存在一個(gè)VNTR序列。2014年，Godfrey Essien Etokebe等人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM46A基因與在克羅地亞人群肺結(jié)核易感性相關(guān)，并認(rèn)為 VNTR可以參與調(diào)控形態(tài)發(fā)育，基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的功能等生物過程，但在其他人群中未見相關(guān)報(bào)道。
　　早期B細(xì)胞因子1(EBF1)基因位于染色體5q34，是編碼B細(xì)胞特異性因子，2012年

4、，Eileen Png等人研究發(fā)現(xiàn)，EBF1基因rs10515787位點(diǎn)多態(tài)性與印第安人群的肺結(jié)核易感性相關(guān)，由于機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的免疫反應(yīng)主要與 T淋巴細(xì)胞有關(guān)，所以作者推斷該基因不僅參與 B細(xì)胞免疫，而且通過 NOTCH信號(hào)傳導(dǎo)在 T細(xì)胞定向分化中亦扮演著非常重要的角色，影響宿主對(duì)胞內(nèi)菌感染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，但這一論點(diǎn)缺少更多的實(shí)驗(yàn)支持，Eileen Png的研究結(jié)果是種族遺傳差異還是普遍現(xiàn)象？在中國人群中是否也存在這一發(fā)病機(jī)制

5、？有待進(jìn)一步的研究。
　　多項(xiàng)研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22基因（PTPN22）與多種免疫性疾病有關(guān)。該基因定位于1號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶，編碼蛋白酪氨酸磷酸酶(Lyp)， LYP可以抑制T細(xì)胞活化，限制T細(xì)胞活化的信號(hào)通路，引起相關(guān)疾病。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PTPN22基因rs2488457位點(diǎn)與I型糖尿病、自發(fā)性蕁麻疹等免疫性疾病有關(guān)。2009年，Lamsyah等研究發(fā)現(xiàn)PTPN22基因rs33996649位點(diǎn)與摩洛哥人群

6、肺結(jié)核的易感性有關(guān)。那么PTPN22基因rs2488457位點(diǎn)是否與肺結(jié)核的易感性相關(guān)？PTPN22基因 rs33996649位點(diǎn)是否與中國漢族人群肺結(jié)核的發(fā)生有關(guān)？這還有待進(jìn)一步的研究。
　　本次實(shí)驗(yàn)選取FAM46A基因的VNTR位點(diǎn)，EBF1基因的rs10515787位點(diǎn)及PTPN22基因rs2488457和rs33996649位點(diǎn)，通過分析這四個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與河南漢族人群肺結(jié)核易感性的相關(guān)性，探索以上幾個(gè)位點(diǎn)是否具有種族和地域

7、的差異，為制定有效的PTB預(yù)防、診斷和治療方法提供一定的參考和理論依據(jù)。
　　研究對(duì)象：
　　病例組：收集200例來自河南安陽和新鄉(xiāng)傳染病醫(yī)院的初診肺結(jié)核患者的血液標(biāo)本，年齡范圍在20-56之間，平均年齡為38.9±17.6歲，其中男性受試者146人，女性受試者54人，肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)與2008年我國衛(wèi)生部制定的WS288-2008診斷標(biāo)準(zhǔn)一致。排除其它免疫性疾病感染，如糖尿病、HIV感染等，以及使用免疫抑制劑的患者。

8、>　　對(duì)照組：隨機(jī)選取200名同期體檢的健康個(gè)體，年齡范圍在20-52歲之間，平均年齡為36.0±15.7歲，其中男性受試者178人，女性受試者22人，排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。
　　所有病例組和對(duì)照組的研究對(duì)象均來自河南地區(qū)，研究對(duì)象之間無血緣關(guān)系。以上所有受檢個(gè)體均得到本人或監(jiān)護(hù)人知情同意。
　　研究方法：
　　抽取研究對(duì)象2ml的外周血，酚-氯仿法提取基因組DNA。STR-PCR方法擴(kuò)增FAM46A基因VNTR位點(diǎn)，擴(kuò)增

9、片段用2.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用毛細(xì)管電泳（CE）檢測(cè)其多態(tài)性，并分別用其重復(fù)次數(shù)來命名VNTR的等位基因類型。PCR擴(kuò)增 EBF1基因 rs10515787， PTPN22基因 rs2488457和rs33996649等位點(diǎn)，擴(kuò)增片段用2.0%的瓊脂糖凝膠一并進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后分別經(jīng)過TasⅠ、SacⅠ和MspⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，并分別用2.0%、3.5%和2.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切片段進(jìn)行基因型檢測(cè)，紫外分析凝膠成像系

10、統(tǒng)觀察并記錄。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：
　　使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05），并根據(jù)運(yùn)行結(jié)果，以O(shè)R值及95%置信區(qū)間來評(píng)估基因突變對(duì)肺結(jié)核發(fā)生的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。各位點(diǎn)對(duì)照組均使用HWE1.20軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg檢測(cè)，評(píng)估所選資料的人群代表性。運(yùn)用MDR Software程序包（版本0.6.1）分析基因-基因間的交互作用。
　　結(jié)果：
　　1、對(duì)照組中，所檢測(cè)的四個(gè)基因位

11、點(diǎn)的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），具有較好的人群代表性。
　　2、FAM46A基因VNTR檢測(cè)出4種等位基因，分別為1、2、3、4；檢測(cè)到9種基因型，分別為1/1、1/2、2/2、1/3、2/3、3/3、2/4、3/4、4/4。相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)顯示2/2基因型與河南漢族肺結(jié)核的易感性呈正相關(guān)，2/3基因型與肺結(jié)核的易感性呈負(fù)相關(guān)。
　　3、EBF1基因rs10515787位點(diǎn)，在患者組和對(duì)照組

12、之間，等位基因和基因型頻率的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AA基因型以及A等位基因是肺結(jié)核的發(fā)病危險(xiǎn)因子。
　　4、PTPN22基因rs2488457位點(diǎn)GC基因型頻率在兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)顯示與河南漢族肺結(jié)核的易感性呈負(fù)相關(guān)。
　　5、在河南漢族人群中未發(fā)現(xiàn)PTPN22基因rs33996649位點(diǎn)多態(tài)性，對(duì)所有受試個(gè)體的檢測(cè)結(jié)果全部為CC基因型。
　　6、EBF1基因rs