人Ⅲ型膠原蛋白基因的克隆及其對畢赤酵母的轉(zhuǎn)化.pdf

1、膠原蛋白(collagens)是一類細胞外基質(zhì)蛋白，在維護各種組織的結(jié)構(gòu)完整性方面，扮演著重要的角色。膠原蛋白具有獨特結(jié)構(gòu)，并因此而具而有低抗原性和優(yōu)良的生物相容性，使其成為一種重要的生物醫(yī)學材料，而且這種重要性與日俱增，但膠原主要是從動物的組織中提取的，這樣會帶來很多麻煩，如免疫排斥和病原菌的污染，因此，利用高效的、規(guī)?；闹亟M體系統(tǒng)來生產(chǎn)重組人膠原將得到廣泛的應(yīng)用。
　　本研究以流產(chǎn)胎兒的胎皮等為試材，用Trizol提取其總R

2、NA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈，設(shè)計特異引物，引入EcoRI和NotI雙酶切位點，優(yōu)化PCR條件，擴增出317bp的目的條帶，經(jīng)測序并與GenBank上公布的人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈基因序列比對，其相似性達99.66％。同時，根據(jù)畢赤酵母的密碼子使用情況，人工設(shè)計并合成了317bp的優(yōu)化基因，將其和天然的人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈三肽區(qū)基因分別與表達載體pET28a-連接，獲得重組原核表達載體pET-28a-ColⅢ(N)和pET-28a-Co

3、lⅢ(A)，將兩個重組原核表達載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌中進行誘導表達，SDS-PAGE電泳顯示，在13kD處出現(xiàn)蛋白特異條帶，與預期蛋白大小相符，初步表明目的基因在原核細胞獲得表達。
　　將人Ⅲ型膠原蛋白的α1鏈三肽區(qū)基因和密碼子優(yōu)化的類人膠原基因插入到畢赤酵母表達載體pPIC9K上，構(gòu)建出酵母表達載體pPIC9K-ColⅢ(N)和pPIC9K-ColⅢ(A)。經(jīng)測序無誤后將重組質(zhì)粒用SacⅠ線性化，分別電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS