肝靶向肽CSPI-plus修飾的重組人內皮抑素對HepG2肝癌細胞的作用研究.pdf

1、肝細胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生是一個多因素多階段的復雜過程，迄今沒有有效的根治辦法。尋求新的治療方法和治療新靶標是目前肝細胞性肝癌治療的迫切需求。目前國內外研究一直致力于通過阻斷腫瘤新生血管形成來達到治療腫瘤的目的。血管生成抑制劑，特別是多肽或內源性肽可能成為異常血管生成依賴性疾病最安全最低毒的治療措施。內皮抑制素（endostatin）是膠原蛋白XVIII羧基末端水解而來的20 kDa多

2、肽片段，是一種內源性血管形成抑制因子，特異性地抑制內皮細胞增生和遷移，對血管形成及腫瘤生長具有明顯抑制作用。此外研究證實內皮抑素對乳腺癌、大腸癌等腫瘤細胞也具有直接的抑制作用。但正如許多血管生成抑制劑一樣，內皮抑素單一給藥并不能獲得顯著地療效，加之蛋白制劑存在的問題從而使美國于2003年終止對內皮抑素的臨床開發(fā)。近年來靶向制劑的研究儼然已經成為國內外藥劑研究的熱點之一。CSP I-plus是從瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白（ Circumsproz

3、oite protein, CSP）中篩選得到的能夠特異識別并黏附在肝細胞表面的多肽序列。利用CSP I-plus的這一特性，本實驗室采用基因工程技術和原核表達系統(tǒng)成功制備新型肝靶向人內皮抑素rES-CSP。目前，該融合蛋白對內皮細胞的抑制作用以及肝靶向性已經得到證實，但對肝癌細胞的作用尚無研究報道，有待進一步探討。
　　本論文意在進一步從體內原位肝癌模型驗證rES-CSP肝靶向性的基礎上，采用HepG2細胞和裸鼠原位肝癌模型從細

4、胞和動物整體水平評價其抗肝癌效果并初步探討凋亡相關的分子機制。
　　研究目的：
　　本論文通過研究新型肝靶向人內皮抑素rES-CSP對肝癌細胞的直接抑制作用，為rES-CSP抑制肝癌生長的作用靶點進行了補充，從而為肝癌靶向治療提供新的科學依據和藥物開發(fā)思路。
　　研究方法：
　　1.探討rES-CSP的肝靶向性
　　1.1. rES-CSP的裸鼠體內分布實驗：建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型，通過瘤塊種植法法建立

5、肝原位移植瘤模型。將裸鼠隨機分為空白對照（生理鹽水）組，重組人血管內皮抑素（rEndostatin）組，融合蛋白（rES-CSP）組。建模1月后單次尾靜脈給藥，分別于5、30和60 min取血后處死動物，取心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織制備勻漿，ELISA方法測定各樣品中內皮抑素濃度。
　　2.探討rES-CSP的體外抗HCC作用及凋亡相關分子機制
　　2.1. MTS方法分別檢測給予終濃度為12μM、6μM、1.2μM、0.

6、6μM、0.06μM的重組人血管內皮抑制素、CSPI-plus和肝靶向人內皮抑素rES-CSP作用24 h和48 h后對HepG2、Chang’s和A549細胞的毒性作用，以選擇合適的藥物濃度進行后續(xù)的活性研究。其后，分別從遷移分析、流式細胞術和透射電鏡來考察rES-CSP抗肝癌細胞遷移及對細胞周期和凋亡的影響。
　　2.2.Western Blot檢測rES-CSP誘導肝癌細胞凋亡的相關分子機制，分別給予終濃度為0.6μM、6μ

7、M的重組人內皮抑制素和肝靶向人內皮抑素rES-CSP作用24 h后收集細胞并裂解，提取蛋白后分別與凋亡蛋白Caspase8抗體、凋亡抑制蛋白Bcl-2抗體進行免疫印跡實驗，檢測并分析細胞內Caspase8和Bcl-2的表達變化。
　　3.探討rES-CSP的體內抗HCC作用
　　3.1.建立肝原位移植瘤模型，實驗動物隨機分為3組，每組10只：①空白組(生理鹽水)，②rEndostatin(6μM)組，③rES-CSP(6μM

8、)組。建模1周后隔天靜脈給藥，連續(xù)用藥30天。處死動物，觀察肝臟腫瘤生長情況，剝離肝組織中的瘤塊稱瘤重，計算抑瘤率；
　　3.2.取肝癌組織做石蠟切片，HE染色觀察組織的病理學改變。免疫組化比較肝癌組織中CD31的表達變化。
　　4.數據統(tǒng)計與分析：實驗數據均以均數與標準差（x?s）表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理實驗數據。采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊時多重比較采用LSD法；方差不齊時，

9、多重比較采用Dunnett T3法。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　實驗結果：
　　1.探討rES-CSP的肝靶向性:
　　1.1.肝原位種植瘤模型制備：取人肝癌細胞系HepG2制備皮下移植瘤，后將腫瘤組織接種于裸鼠肝內，建立裸鼠肝原位移植瘤模型。
　　1.2.rES-CSP的裸鼠體內分布實驗：荷肝癌原位裸鼠尾靜脈給藥，ELISA方法測定給藥后5、30和60 min時裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腫瘤

10、組織和血液中內皮抑素濃度，結果顯示肝靶向內皮抑素與普通重組人內皮抑素組相比，各臟器內皮抑素濃度均有顯著性差異（P﹤0.05）；各時間點肝靶向人內皮抑素rES-CSP組肝臟及肝癌組織內皮抑素濃度均高于普通內皮抑素組（P﹤0.01）。
　　2.探討rES-CSP的體外抗HCC作用及凋亡相關分子機制
　　2.1.細胞毒性實驗：MTS結果顯示rES-CSP對HepG2細胞的增殖有抑制作用，且呈時間和劑量的依賴性。而CSP I-plu

11、s、rEndostatin均對肝癌細胞的增殖幾乎無影響。同時在低濃度時，rES-CSP對肝癌細胞的抑制作用明顯高于Chang’s和A549細胞（P﹤0.01）。在6μM時，HepG2細胞的存活率為46.3±2.31％，Chang’s和A549細胞的存活率分別為92.8±2.11%、93.2±2.96%。
　　2.2.細胞遷移實驗：隨著時間的推移，rES-CSP組能顯著抑制肝癌細胞劃痕的愈合，與重組人內皮抑素組相比，差異具有統(tǒng)計學意

12、義（P﹤0.05）。同時 Transwell小室實驗顯示，與空白對照組相比，經6μM rEndostatin或rES-CSP處理后的肝癌細胞遷移到下室的數量明顯減少(P值均﹤0.05)，遷移抑制率分別為27±1.75%、65.5±2.95%。
　　2.3.流式細胞術檢測細胞周期和凋亡：結果顯示，6μMrEndostatin作用24 h和48 h后，肝癌細胞的周期分布和凋亡幾乎不受影響（P＞0.05）。而rES-CSP顯著誘導肝癌細

13、胞G2/M期細胞數目增加同時伴隨著G0/G1和S期細胞減少(P﹤0.01)，同時肝癌細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率顯著高于對照組細胞（P﹤0.01）。
　　2.4.透射電鏡觀察細胞的凋亡：結果顯示rES-CSP處理后，肝癌細胞多出現中晚期凋亡，可見細胞膜出芽，凋亡小體形成，內含有退變的細胞器。核碎裂，核固縮，胞核染色質邊集、成碎塊狀，核膜消失。
　　2.5.Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達變化：rES-

14、CSP可顯著降低Bcl-2蛋白表達水平，同時可能上調Caspase8蛋白的表達。rEndostatin處理組對Bcl-2和Caspase8兩種蛋白的表達影響不明顯。
　　3.探討rES-CSP的體內抗HCC作用及相關分子表達變化
　　3.1.體內對裸鼠肝癌原位移植瘤的抑制作用：rES-CSP組與重組人血管內皮抑素組、對照組相比，瘤重和瘤體積均有顯著性差異（P＜0.05），結果表明rES-CSP能顯著抑制人肝癌裸鼠原位移植瘤的

15、生長，重組人內皮抑素對肝癌的生長抑制作用不明顯；rES-CSP和rEndostatin組的人肝癌裸鼠荷瘤的抑瘤率為29.6±4.39%和5.30±1.23%。
　　3.2.HE染色觀察組織的病理變化：肝癌細胞呈浸潤性生長，rES-CSP組同實驗對照組相比，rES-CSP組癌組織多發(fā)生壞死，間質血管少于對照組，癌細胞核分裂相對減少，可見有大量白細胞和淋巴細胞浸潤，表明 rES-CSP組對癌細胞生長有一定的抑制作用。然而部分肺病理切片

16、觀察可見肺泡間隔增厚，肺泡壁和細支氣管壁有較多炎性細胞浸潤，顯示出較重的間質性肺炎病變。
　　3.3.免疫組織化學檢測肝癌組織中微血管密度和凋亡抑制蛋白 Bcl-2的表達變化：與對照組相比，rEndostatin組和rES-CSP組腫瘤組織微血管密度相對減小，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　　肝靶向肽CSP I-plus修飾的重組人內皮抑素能靶向結合于肝細胞表面分子HSPG，從而在肝臟組織得到

17、明顯富集。體外抗HCC活性實驗證實rES-CSP可顯著抑制肝癌細胞的增殖和遷移，阻滯細胞的復制周期，并且增加肝癌細胞的凋亡率。動物實驗證實，rES-CSP能夠顯著抑制裸鼠原位肝癌的生長，作用效果顯著強于重組人血管內皮抑制素，并且肝癌組織CD31蛋白表達下調與重組人血管內皮抑制素組相比具有顯著差異。綜上所述，肝靶向肽CSP I-plus修飾的重組人內皮抑素能在肝臟組織富集，從而提高內皮抑素對肝癌細胞的靶向抑制作用，為肝癌的靶向治療提供新的