納米羥基磷灰石攜載lefty-1基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞的殺傷效應(yīng).pdf

1、基因治療的關(guān)鍵是在于選擇合適的基因載體。納米羥基磷灰石（HAp）具有良好的生物相容性和生物降解性在基因載體中有著廣泛的運(yùn)用。本課題通過(guò)水熱共沉淀法合成了三種納米HAp顆粒，并將顆粒負(fù)載質(zhì)粒DNA（pDNA），研究其基因負(fù)載量和對(duì)基因釋放性能。對(duì)納米HAp顆粒進(jìn)行體外降解性能研究，并觀察顆粒是否能夠進(jìn)入細(xì)胞以及可能的入胞機(jī)制。最后，研究其攜載lefty-1基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞的殺傷效果，并對(duì)納米HAp顆粒的生物相容性進(jìn)行了檢測(cè)。具體研究?jī)?nèi)容

2、和結(jié)果如下：
　　1）分別以十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）、聚乙烯亞胺（PEI）和絲膠蛋白為調(diào)控劑，共沉淀法成功制備三種納米HAp顆粒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：合成的三種顆粒形貌分別為棒狀、長(zhǎng)梭狀和球形，主要晶型都為羥基磷灰石，平均長(zhǎng)徑大小分別150 nm、350 nm和50 nm左右，有機(jī)物的含量分別為3.81％、8.96%和7.41%。
　　2）體外HAp顆粒降解實(shí)驗(yàn)在不同pH值的PBS溶液中進(jìn)行，研究其體外降解性能，并對(duì)降解9

3、1天后的顆粒進(jìn)行表征測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HAp顆粒在弱酸性條件下降解速度最快，降解百分比也最大，且降解具有pH響應(yīng)性。降解后長(zhǎng)梭狀顆粒的形貌發(fā)生部分變化，出現(xiàn)棒狀和針狀形貌，顆粒的粒徑變小，但顆粒的主要晶型沒(méi)有改變。說(shuō)明制備的納米HAp顆粒是一種可降解的材料，可作為一種緩釋性基因載體。
　　3）通過(guò)混合孵育法制備HAp-pDNA復(fù)合物并研究其負(fù)載效率，以及在不同pH條件下基因的釋放效率；將制備的HAp-pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)

4、胞（MCF-7和MDA-MB-231），研究其轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：制備的三種納米HAp顆粒都能有效地負(fù)載質(zhì)粒DNA，并且在弱酸性pH條件下可實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒DNA的持續(xù)釋放，具有一定的pH響應(yīng)性。制備的HAp-pDNA復(fù)合物成功轉(zhuǎn)染了人乳腺癌細(xì)胞，并且經(jīng)PEI調(diào)控合成的長(zhǎng)梭狀納米HAp顆粒對(duì)MCF-7細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)染效率。
　　4）細(xì)胞攝取顆粒實(shí)驗(yàn)通過(guò)FITC-羅丹明鬼筆環(huán)肽染色實(shí)驗(yàn)和TEM直接觀察法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：納米HAp

5、顆粒能夠被細(xì)胞攝取，進(jìn)入細(xì)胞后分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。顆粒進(jìn)入細(xì)胞的方式主要是通過(guò)胞吞作用，以吞噬小泡的方式進(jìn)入細(xì)胞。分散在培養(yǎng)液中的顆粒進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)團(tuán)聚在一起，并且對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理后能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)顆粒的攝取能力。
　　5）通過(guò)LDH乳酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)和MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顆粒的生物相容性，同時(shí)，將HAp顆粒負(fù)載lefty-1基因，研究其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，并通過(guò)hocehst染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

6、所制備的納米HAp顆粒對(duì)人乳腺上皮細(xì)胞表現(xiàn)極低的細(xì)胞毒性，具有良好的生物相容性。納米HAp顆粒攜載lefty-1基因后對(duì)人乳腺癌細(xì)胞具有良好的殺傷效果，且殺傷效率達(dá)到40%左右。Hocehst染色和流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明lefty-1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞的殺傷效應(yīng)主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。本研究首次證明了人源lefty-1基因?qū)θ巳橄侔┘?xì)胞的殺傷效應(yīng)，納米HAp顆粒攜載lefty-1基因用于乳腺癌治療研究有望成為乳腺癌基因治療的一個(gè)新方向。