rAAV介導(dǎo)的HSVtk自殺基因系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞殺傷機(jī)理的初步研究.pdf

1、乳腺癌是人類常見的一種惡性腫瘤，也是女性主要惡性腫瘤之一。手術(shù)、放療、化療是目前腫瘤治療的主要手段。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因治療成為腫瘤治療的新模式。自殺基因療法是基因治療的策略之一，它通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法將哺乳動(dòng)物不含有的藥物酶基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，其表達(dá)產(chǎn)物可將無(wú)毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為有毒性的代謝產(chǎn)物，影響細(xì)胞的生物合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究以人類乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的含Tet-O

2、n調(diào)控元件的HSVtk自殺基因系統(tǒng)對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)行殺傷性試驗(yàn)，并利用基因芯片、RT-PCR、Western Blotting等手段對(duì)該系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞殺傷作用的分子機(jī)理進(jìn)行初步研究。本研究分為兩個(gè)部分： 第一章rAAV介導(dǎo)的HSVtk自殺基因系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用。通過(guò)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染pAAV/TRE/Tet-On/HSVtk、pHelper、pAAV-RC三質(zhì)粒至病毒包裝細(xì)胞HEK293T，獲得了重組腺相關(guān)病毒rAAV/T

3、RE/Tet-On/HSVtk。經(jīng)純化后，以斑點(diǎn)雜交的方法檢測(cè)并計(jì)算得到所獲得的rAAV的病毒物理滴度為3.49×1011/ml。培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，以rAAV/TRE/Tet-On/HSVtk、Dox、GCV的不同組合處理該細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為rAAV+Dox+GCV組、rAAV+GCV組、rAAV+Dox組、rAAV組及陰性對(duì)照組。通過(guò)MTT試驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)藥物處理細(xì)胞72h后，rAAV+Dox+GCV組的細(xì)胞相對(duì)其他各

4、組，細(xì)胞相對(duì)數(shù)量顯著減少（P<0.05）。以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSVtk自殺基因系統(tǒng)處理MCF-7細(xì)胞后細(xì)胞周期的改變情況，發(fā)現(xiàn)rAAV+Dox+GCV組的細(xì)胞相對(duì)其他各組細(xì)胞，S期的細(xì)胞顯著增多（P<0.05），表明該系統(tǒng)干預(yù)乳腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞周期S期受阻。 第二章rAAV介導(dǎo)的HSVtk自殺基因系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞殺傷機(jī)理的初步研究。藥物處理乳腺癌細(xì)胞MCF-748 h后，提取細(xì)胞的總RNA，利用全基因芯片檢測(cè)藥物對(duì)該細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)

5、譜的影響。結(jié)果顯示，rAAV+Dox+GCV處理組細(xì)胞相對(duì)與其他各處理組細(xì)胞：上調(diào)基因246個(gè)，下調(diào)基因64個(gè)，其中與DNA復(fù)制、DNA損傷與修復(fù)相關(guān)的基因比較多，以及很多鋅指結(jié)構(gòu)蛋白。RT-PCR驗(yàn)證了p21與PCNA在rAAV+Dox+GCV處理組與陰性對(duì)照組細(xì)胞之間的表達(dá)差異，結(jié)果顯示p21表達(dá)顯著上調(diào)，而PCNA表達(dá)顯著下調(diào)，與芯片結(jié)果一致。進(jìn)一步利用Western Blotting研究藥物干預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)p21、PCNA、CD

6、K1、Cyclin B、p53及磷酸化p53（Ser6）等蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照組，rAAV+Dox+GCV處理組的p21蛋白表達(dá)量上調(diào)，而PCNA、CDK1、Cyclin B等蛋白表達(dá)量下調(diào)；而p53及磷酸化p53（Ser6）的表達(dá)在rAAV+Dox+GCV處理組與陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。因此我們推測(cè)，HSVtk自殺基因系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的殺傷作用可能是通過(guò)一種非p53依賴性的途徑上調(diào)p21的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致