HMGB1-TLR2信號(hào)通路在術(shù)后認(rèn)知功能障礙和缺血再灌注肺損傷中的作用及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、第一部分 TOLL樣受體介導(dǎo)的中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)在術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的作用
　　目的：探討TOLL樣受體介導(dǎo)的腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)在無菌性手術(shù)創(chuàng)傷引起的術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的作用。
　　方法：構(gòu)建異氟醚麻醉下行頸動(dòng)脈剝離手術(shù)的小鼠手術(shù)模型，首先，將CD-1小鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和對(duì)照組（n=6），通過蛋白印跡法檢測(cè)術(shù)后6小時(shí)小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織的總蛋白和膜蛋白中TLR2、TLR4、TLR9的表達(dá)情況；其次，將CD-1小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照

2、組、CU-CPT22（TLR1/TLR2抑制劑）組、手術(shù)組、手術(shù)+CU-CPT22組，CU-CPT22于手術(shù)前30分和術(shù)后一天分別予腹腔內(nèi)注射3 mg/kg，通過巴恩斯迷宮和條件相關(guān)恐懼實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠術(shù)后學(xué)習(xí)記憶能力的變化（n=15），通過Elisa法檢測(cè)術(shù)后12小時(shí)小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織內(nèi)IL-1β、IL-6的表達(dá)（n=6）；最后，通過雙染色免疫熒光技術(shù)觀察TLR2分別與神經(jīng)元標(biāo)記物（NeuN）、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（GFAP）、小膠質(zhì)細(xì)

3、胞標(biāo)記物（Iba-1）的定位情況。
　　結(jié)果：與對(duì)照組比較，右頸動(dòng)脈剝離術(shù)后6小時(shí)的大腦皮質(zhì)和海馬的總蛋白和膜蛋白中TLR2、TLR4表達(dá)均明顯增高（P<0.05），而TLR9的總蛋白和膜蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較均無顯著性差異（P>0.05）。與對(duì)照組比較，術(shù)后12小時(shí)大腦皮質(zhì)和海馬的IL-6表達(dá)及大腦海馬的IL-1β表達(dá)明顯增高（P<0.05），CU-CPT22處理后能明顯減輕手術(shù)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)和海馬的IL-1β和IL-6表達(dá)。

4、在四天的空間記憶訓(xùn)練過程中，訓(xùn)練天數(shù)對(duì)大鼠找到目標(biāo)洞的時(shí)間有顯著性影響（P<0.05）；在長(zhǎng)期記憶測(cè)試中，手術(shù)組的小鼠找到目標(biāo)洞的時(shí)間較對(duì)照組明顯增加（P<0.05），CU-CPT22處理后能明顯縮短手術(shù)創(chuàng)傷后小鼠找到目標(biāo)洞的時(shí)間（P<0.05），在短期記憶測(cè)試中，有相同的變化趨勢(shì)，但是其結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在背景相關(guān)恐懼記憶測(cè)試中，手術(shù)組小鼠的凝固行為時(shí)間比對(duì)照組明顯減少，CU-CPT22能明顯增加手術(shù)創(chuàng)傷后小鼠的凝固

5、行為時(shí)間（P<0.05）；在聲音相關(guān)恐懼記憶測(cè)試中，各個(gè)組小鼠的凝固行為時(shí)間之間比較沒有顯著性差異（P>0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示：手術(shù)刺激后TLR2在小鼠腦內(nèi)的表達(dá)明顯增多，TLR2的表達(dá)位點(diǎn)與NeuN明顯重合，與Iba-1部分重合，與GFAP完成不重合。
　　結(jié)論：無菌性手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的術(shù)后認(rèn)知功能障礙與腦內(nèi)TLR2、TLR4激活介導(dǎo)的中樞神經(jīng)炎性反應(yīng)有關(guān)；手術(shù)創(chuàng)傷后腦內(nèi)TLR2的激活主要來源于神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。

6、　　第二部分腦內(nèi)HMGB1的激活對(duì)TLR2表達(dá)的影響及其調(diào)控機(jī)制研究
　　目的：探討無菌性手術(shù)創(chuàng)傷后，腦內(nèi)HMGB1對(duì)TLR2表達(dá)的影響以其調(diào)控機(jī)制。
　　方法：構(gòu)建異氟醚麻醉下行頸動(dòng)脈剝離手術(shù)的小鼠手術(shù)模型，首先，將CD-1小鼠隨機(jī)分為手術(shù)組和對(duì)照組（n=10），通過蛋白印跡法檢測(cè)術(shù)后6小時(shí)小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織的核蛋白和漿蛋白中HMBG1的表達(dá)情況；其次，將CD-1小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組、Glycyrrhizin（HMGB

7、1抑制劑）組、手術(shù)組、手術(shù)+Glycyrrhizin組（n=6），Glycyrrhizin于手術(shù)前30分腹腔內(nèi)注射200 mg/kg，通過蛋白印跡法檢測(cè)術(shù)后6小時(shí)小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織的核蛋白和漿蛋白中HMBG1的表達(dá)以及總蛋白和膜蛋白TLR2的表達(dá)情況；最后，通過染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）檢測(cè)HMGB1對(duì)TLR2啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。
　　結(jié)果：與對(duì)照組比較，右頸動(dòng)脈剝離術(shù)后6小時(shí)的大腦皮質(zhì)和海馬的核蛋白HMGB1表達(dá)明

8、顯增高（P<0.05），而漿蛋白HMGB1表達(dá)與對(duì)照組無顯著性差異（P>0.05），Glycyrrhizin預(yù)處理能明顯減輕手術(shù)創(chuàng)傷引起的核蛋白HMGB1表達(dá)增高（P<0.05）。與對(duì)照組比較，術(shù)后大腦皮質(zhì)和海馬的總蛋白和膜蛋白中TLR2表達(dá)均明顯增高，Glycyrrhizin預(yù)處理能明顯減輕手術(shù)創(chuàng)傷引起的TLR2表達(dá)增高（P<0.05）。在沉淀富集HMGB1蛋白的DNA片段中，PCR檢測(cè)顯示手術(shù)組的海馬組織在-283bp~-71 bp

9、啟動(dòng)子區(qū)域的TLR2 DNA含量比對(duì)照組明顯增高（P<0.05）。
　　結(jié)論：抑制HMGB1在腦內(nèi)的表達(dá)能有效減少手術(shù)創(chuàng)傷后腦內(nèi)TLR2的激活； HMGB1可通過激活-283bp~-71 bp區(qū)域的TLR2啟動(dòng)子，促進(jìn)TLR2的轉(zhuǎn)錄過程來實(shí)現(xiàn)對(duì)TLR2的調(diào)控作用。
　　第三部分 HMGB1/TLR2信號(hào)通路在肺缺血再灌注損傷中的作用
　　目的：探討HMGB1/TLR2信號(hào)通路在缺血再灌注肺損傷發(fā)生過程中的作用。

10、　　方法：構(gòu)建小鼠肺缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型，首先，將BALB/C小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Control組）、假手術(shù)組（Sham組）和缺血再灌注組（I/R組）組（n=6），收集缺血再灌注側(cè)肺組織標(biāo)本通過HE染色法觀察肺組織損傷情況并評(píng)分，通過檢測(cè)肺濕干重比評(píng)價(jià)肺水腫情況，通過蛋白印跡法檢測(cè)小鼠肺組織總蛋白TLR2的表達(dá)、核蛋白和漿蛋白HMGB1的表達(dá)，通過Elisa檢測(cè)肺組織IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達(dá)；其次，將BALB/C小鼠隨機(jī)

11、分為對(duì)照組（Control組）、Glycyrrhizin（HMGB1抑制劑）組、缺血再灌注組（I/R組）、缺血再灌注+ Glycyrrhizin組（I/R+Gly組），Glycyrrhizin于手術(shù)前30分腹腔內(nèi)注射200 mg/kg，同樣收集缺血再灌注側(cè)肺組織標(biāo)本檢測(cè)各組肺組織的肺損傷評(píng)分、肺濕干重比、HMGB1和TLR2蛋白的表達(dá)、以及炎癥因子IL-1β、IL-6的表達(dá)；最后，通過染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）檢測(cè)HMGB1對(duì)TLR

12、2啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。
　　結(jié)果： HE染色后光鏡下觀察顯示：Control組：肺組織未見病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)和各級(jí)支氣管上皮完整，肺泡間隔正常，無明顯肺間質(zhì)水腫，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；Sham組：肺組織未見明顯的病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)和各級(jí)支氣管上皮大部分完整，肺間隔稍增寬，可見有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；I/R組：肺組織損傷明顯，肺泡間隔結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡內(nèi)可見明顯水腫及出血，大量炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。肺損傷評(píng)分分別為：對(duì)照組：1.6±0.3；Sh

13、am組：12.4±1.3；I/R組：28.5±2.1。與Control組和Sham組比較，I/R組肺組織的W/D比值顯著升高（P＜0.05），核蛋白和漿蛋白中HMGB1表達(dá)、TLR2總蛋白表達(dá)均明顯增高（P<0.05）；炎癥因子IL-1β和IL-6的表達(dá)亦顯著升高（P<0.05）。Control組和Sham組之間比較，Sham組也能導(dǎo)致肺損傷一定程度的損傷，HMGB1核蛋白、TLR2總蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.05），但HMGB1漿蛋白

14、無明顯變化（P>0.05）；炎癥因子IL-1β和IL-6的表達(dá)亦顯著升高（P<0.05）。與I/R組相比，I/R+Gly組能顯著抑制HMGB1、TLR2總蛋白的表達(dá)，抑制炎癥因子IL-1β和IL-6的表達(dá)，并減輕缺血再灌注導(dǎo)致肺損傷的程度。Control組和Glycyrrhizin組之間比較各項(xiàng)指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。在沉淀富集HMGB1蛋白的DNA片段中，PCR檢測(cè)顯示缺血再灌注組的TLR2啟動(dòng)子區(qū)域的DNA含量與對(duì)照組相比