沉默Matriptase對(duì)胰腺癌細(xì)胞株SW1990及移植瘤生長(zhǎng)的影響.pdf

1、第一部分沉默Matriptase對(duì)胰腺癌細(xì)胞株SW1990生長(zhǎng)的影響
　　目的：探討沉默Matriptase對(duì)胰腺癌株SW1990體外生長(zhǎng)的影響，并探討其對(duì)胰腺癌細(xì)胞株SW1990可能的作用機(jī)制。
　　方法：根據(jù)Genbank中Matriptase的編碼區(qū)基因序列 NM_021978.3及相關(guān)參考文獻(xiàn)，合成特異性針對(duì)Matriptase的siRNA及與Matriptase無(wú)關(guān)的陰性對(duì)照siRNA，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株SW19

2、90；實(shí)驗(yàn)分為4組：陰性對(duì)照組（A組）、12.5 nM（B組）、25 nM(C組）、50 nM Matriptase-siRNA組（D組）；利用real time PCR技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染后24h各組細(xì)胞中Matriptase在mRNA水平上的相對(duì)表達(dá)量；Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24 h各組細(xì)胞Matriptase在蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量；明膠酶譜檢測(cè)各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后Matriptase酶活性及MMP-9表達(dá)量的變化，CC

3、K-8檢測(cè)各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞增殖能力的變化；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞遷移力的變化；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞侵襲力的變化。Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24 h后uPA/pro-uPA、HGF、AKT、p-AKT、E-cadherin表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　?。?）胰腺癌細(xì)胞株SW1990、AsPC-1中都有Matriptase的高表達(dá)，SW1990

4、、AsPC-1的蛋白表達(dá)量分別為（0.94±0.63）、（1.58±0.15）；胰腺癌細(xì)胞株 PaTU8988中無(wú)Matriptase的表達(dá)。
　?。?）胰腺癌細(xì)胞株SW1990在轉(zhuǎn)染NC、12.5 nM、25 nM、50 nM Matriptase-siRNA24 h后，各組Matriptase mRNA水平分別為1、0.44±0.05、0.28±0.04、0.25±0.07；但 Matriptase蛋白表達(dá)水平分別是0.74±

5、0.06、0.49±0.04、0.34±0.01、0.24±0.05。
　?。?）Matriptase-siRNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖力的變化，各組的24 h的吸光度分別為0.62±0.01、0.62±0.03、0.37±0.05、0.33±0.05；48 h的吸光度分別為0.77±0.05、0.69±0.03、0.48±0.02、0.42±0.05
　　（4）A組及 C組劃痕間距分別為0.061±0.013、0.368±0.0

6、14，可見 C組細(xì)胞的遷移距離明顯降低；而 A組和C組穿膜細(xì)胞數(shù)分別是（416±1.3）與（109±2.8），可見轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株SW1990 Matriptase-siRNA后細(xì)胞的侵襲力明顯降低。
　　(5)Matriptase-siRNA轉(zhuǎn)染前后Matriptase蛋白酶活性及MMP-9的變化，A、B、C、D各處理組的Matriptase酶活性分別1.50±0.16、1.21±0.27、0.64±0.16、0.62±0.03

7、；MMP-9的活性分別為0.93±0.26、0.48±0.36、0.35±0.11、0.35±0.12。其中C組與D組的Matriptase酶活性及MMP-9活性明顯降低（6）經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后A、B、C、D組的uPA/pro-uPA的比值分別為3.52±0.04、1.11±0.11、0.15±0.06、0.12±0.08；p-AKT各組的蛋白表達(dá)量分別為0.91±0.16、0.37±0.20、0.27±0.17、0.09±0.06；AKT蛋

8、白相對(duì)表達(dá)量分別為1.13±0.05、1.01±0.11、1.22±0.19、1.03±0.37；E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.20±0.09、0.87±0.92、0.85±0.08、0.63±0.26；結(jié)果示轉(zhuǎn)染Matriptase-siRNA后 uPA/pro-uPA比值降低，p-AKT表達(dá)量減少，AKT及 E-cadherin表達(dá)量無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：沉默Matriptase使細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯

9、下降。其機(jī)制可能是抑制了Matriptase酶活性，導(dǎo)致pro-uPA的活化降低，進(jìn)而導(dǎo)致MMP-9的活化、AKT的磷酸化減弱，最后細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲下降。
　　第二部分沉默Matriptase對(duì)胰腺癌細(xì)胞株SW1990移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　目的：探討沉默Matriptase對(duì)胰腺癌株移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響，并探討其在體內(nèi)對(duì)胰腺癌細(xì)胞株移植瘤可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　(1)利用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒，并

10、轉(zhuǎn)導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株SW1990用于干擾Matriptase的表達(dá)，利用倒置熒光顯微鏡及流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行細(xì)胞分選，收集穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株；Western blot技術(shù)檢測(cè)干擾效果。
　　(2)建立胰腺癌皮下移植瘤模型：將4周的BALB/c雌性裸鼠分為兩組，分別為空載體組（shNC組）、轉(zhuǎn)染組（shMT1），并監(jiān)測(cè)小鼠的體重、腫瘤大小，待腫瘤體積長(zhǎng)至500 mm3后，動(dòng)物成像儀拍照。頸椎脫臼法處死小鼠，皮下剝離腫瘤

11、，去除包膜，記錄腫瘤的重量及體積。
　　(3)將取下的腫瘤組織 Western blot及免疫組化檢測(cè)各組腫瘤組中Matriptase、MMP-9、E-cadherin量的變化。
　　結(jié)果：
　　（1）shNC組在第7、14、21、28、35天的腫瘤體積分別為（2.236±0.024） mm3、（52.60±0.082）mm3、（130.4±0.023）mm3、（308.1±0.283）mm3、（568.2±0.048

12、） mm3，shMT1組在第7、14、21、28、35天的腫瘤體積分別為（2.197±0.035）mm3、（21.46±0.022）mm3、（78.61±0.012）mm3、（102.7±0.120）mm3、（150.8±0.036）mm3；shNC組的腫瘤重量為0.96±0.27，抑瘤率為（0.0±0.0）％；shMT1組的腫瘤重量為0.43±0.13，抑瘤率為（55.2±2.7）％，可以發(fā)現(xiàn)shMT1組腫瘤體積及重量都明顯降低。

13、r>　?。?）shNC組的Matriptase、MMP-9、E-cadherin的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.23±0.75、0.58±0.11、1.12±0.22；shMT1組的Matriptase、MMP-9、E-cadherin的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.19±0.03、0.09±0.03、1.02±0.07，可發(fā)現(xiàn) shMT1組中的MMP-9表達(dá)量明顯降低，而E-cadherin的表達(dá)無(wú)顯著差異。
　?。?）shNC組中Matr

14、iptase、MMP-9免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)分別為（85±6.78）%、（95±4.50）%；shMT1組中Matriptase、MMP-9免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)分別為（15±2.45）%、（35±2.35）%，同樣發(fā)現(xiàn)shMT1組移植瘤組織中 MMP-9表達(dá)量明顯降低。而 E-cadherin的表達(dá)在shNC組及 shMT1組中無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：沉默Matriptase在裸鼠胰腺癌移植瘤體內(nèi)可抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能