沉默Matriptase對胰腺癌細胞株SW1990及移植瘤生長的影響.pdf

1、第一部分沉默Matriptase對胰腺癌細胞株SW1990生長的影響
　　目的：探討沉默Matriptase對胰腺癌株SW1990體外生長的影響，并探討其對胰腺癌細胞株SW1990可能的作用機制。
　　方法：根據(jù)Genbank中Matriptase的編碼區(qū)基因序列 NM_021978.3及相關參考文獻，合成特異性針對Matriptase的siRNA及與Matriptase無關的陰性對照siRNA，瞬時轉染胰腺癌細胞株SW19

2、90；實驗分為4組：陰性對照組（A組）、12.5 nM（B組）、25 nM(C組）、50 nM Matriptase-siRNA組（D組）；利用real time PCR技術測定轉染后24h各組細胞中Matriptase在mRNA水平上的相對表達量；Western blot技術檢測轉染后24 h各組細胞Matriptase在蛋白水平的相對表達量；明膠酶譜檢測各組細胞在轉染24 h后Matriptase酶活性及MMP-9表達量的變化，CC

3、K-8檢測各組細胞在轉染24 h后細胞增殖能力的變化；劃痕實驗檢測各組細胞在轉染24 h后細胞遷移力的變化；Transwell侵襲實驗檢測各組細胞在轉染24 h后細胞侵襲力的變化。Western blot檢測各組細胞在轉染24 h后uPA/pro-uPA、HGF、AKT、p-AKT、E-cadherin表達量的變化。
　　結果：
　?。?）胰腺癌細胞株SW1990、AsPC-1中都有Matriptase的高表達，SW1990

4、、AsPC-1的蛋白表達量分別為（0.94±0.63）、（1.58±0.15）；胰腺癌細胞株 PaTU8988中無Matriptase的表達。
　?。?）胰腺癌細胞株SW1990在轉染NC、12.5 nM、25 nM、50 nM Matriptase-siRNA24 h后，各組Matriptase mRNA水平分別為1、0.44±0.05、0.28±0.04、0.25±0.07；但 Matriptase蛋白表達水平分別是0.74±

5、0.06、0.49±0.04、0.34±0.01、0.24±0.05。
　　（3）Matriptase-siRNA轉染前后細胞增殖力的變化，各組的24 h的吸光度分別為0.62±0.01、0.62±0.03、0.37±0.05、0.33±0.05；48 h的吸光度分別為0.77±0.05、0.69±0.03、0.48±0.02、0.42±0.05
　　（4）A組及 C組劃痕間距分別為0.061±0.013、0.368±0.0

6、14，可見 C組細胞的遷移距離明顯降低；而 A組和C組穿膜細胞數(shù)分別是（416±1.3）與（109±2.8），可見轉染胰腺癌細胞株SW1990 Matriptase-siRNA后細胞的侵襲力明顯降低。
　　(5)Matriptase-siRNA轉染前后Matriptase蛋白酶活性及MMP-9的變化，A、B、C、D各處理組的Matriptase酶活性分別1.50±0.16、1.21±0.27、0.64±0.16、0.62±0.03

7、；MMP-9的活性分別為0.93±0.26、0.48±0.36、0.35±0.11、0.35±0.12。其中C組與D組的Matriptase酶活性及MMP-9活性明顯降低（6）經轉染處理后A、B、C、D組的uPA/pro-uPA的比值分別為3.52±0.04、1.11±0.11、0.15±0.06、0.12±0.08；p-AKT各組的蛋白表達量分別為0.91±0.16、0.37±0.20、0.27±0.17、0.09±0.06；AKT蛋

8、白相對表達量分別為1.13±0.05、1.01±0.11、1.22±0.19、1.03±0.37；E-cadherin蛋白相對表達量分別為1.20±0.09、0.87±0.92、0.85±0.08、0.63±0.26；結果示轉染Matriptase-siRNA后 uPA/pro-uPA比值降低，p-AKT表達量減少，AKT及 E-cadherin表達量無明顯變化。
　　結論：沉默Matriptase使細胞的增殖、遷移及侵襲能力明顯

9、下降。其機制可能是抑制了Matriptase酶活性，導致pro-uPA的活化降低，進而導致MMP-9的活化、AKT的磷酸化減弱，最后細胞的增殖、遷移及侵襲下降。
　　第二部分沉默Matriptase對胰腺癌細胞株SW1990移植瘤生長的影響
　　目的：探討沉默Matriptase對胰腺癌株移植瘤體內生長的影響，并探討其在體內對胰腺癌細胞株移植瘤可能的作用機制。
　　方法：
　　(1)利用磷酸鈣沉淀法制備慢病毒，并

10、轉導胰腺癌細胞株SW1990用于干擾Matriptase的表達，利用倒置熒光顯微鏡及流式細胞分析儀檢測轉染效果，流式細胞分選儀進行細胞分選，收集穩(wěn)轉細胞株；Western blot技術檢測干擾效果。
　　(2)建立胰腺癌皮下移植瘤模型：將4周的BALB/c雌性裸鼠分為兩組，分別為空載體組（shNC組）、轉染組（shMT1），并監(jiān)測小鼠的體重、腫瘤大小，待腫瘤體積長至500 mm3后，動物成像儀拍照。頸椎脫臼法處死小鼠，皮下剝離腫瘤

11、，去除包膜，記錄腫瘤的重量及體積。
　　(3)將取下的腫瘤組織 Western blot及免疫組化檢測各組腫瘤組中Matriptase、MMP-9、E-cadherin量的變化。
　　結果：
　　（1）shNC組在第7、14、21、28、35天的腫瘤體積分別為（2.236±0.024） mm3、（52.60±0.082）mm3、（130.4±0.023）mm3、（308.1±0.283）mm3、（568.2±0.048

12、） mm3，shMT1組在第7、14、21、28、35天的腫瘤體積分別為（2.197±0.035）mm3、（21.46±0.022）mm3、（78.61±0.012）mm3、（102.7±0.120）mm3、（150.8±0.036）mm3；shNC組的腫瘤重量為0.96±0.27，抑瘤率為（0.0±0.0）％；shMT1組的腫瘤重量為0.43±0.13，抑瘤率為（55.2±2.7）％，可以發(fā)現(xiàn)shMT1組腫瘤體積及重量都明顯降低。

13、r>　?。?）shNC組的Matriptase、MMP-9、E-cadherin的蛋白相對表達量分別為2.23±0.75、0.58±0.11、1.12±0.22；shMT1組的Matriptase、MMP-9、E-cadherin的蛋白相對表達量分別為0.19±0.03、0.09±0.03、1.02±0.07，可發(fā)現(xiàn) shMT1組中的MMP-9表達量明顯降低，而E-cadherin的表達無顯著差異。
　?。?）shNC組中Matr

14、iptase、MMP-9免疫反應陽性細胞指數(shù)分別為（85±6.78）%、（95±4.50）%；shMT1組中Matriptase、MMP-9免疫反應陽性細胞指數(shù)分別為（15±2.45）%、（35±2.35）%，同樣發(fā)現(xiàn)shMT1組移植瘤組織中 MMP-9表達量明顯降低。而 E-cadherin的表達在shNC組及 shMT1組中無明顯差異。
　　結論：沉默Matriptase在裸鼠胰腺癌移植瘤體內可抑制腫瘤的生長與轉移，其機制可能