蛋白酶激活受體2在人胰腺癌細胞SW1990增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用研究.pdf

1、目的：蛋白酶激活受體-2(Proteinase-actived receptors2， PAR-2)是一種細胞膜表面受體，為G蛋白相耦聯(lián)的蛋白酶激活受體超家族成員之一。PAR-2在各個系統(tǒng)及組織中廣泛表達，胰蛋白酶、纖溶酶、凝血因子VIIa和Xa等是其內(nèi)源性激活肽，也可被人工合成的PAR-2選擇性激動劑SLIGKV-NH2激活。國內(nèi)外大量研究表明，PAR-2與消化系統(tǒng)腫瘤密切相關，表達強度顯著高于正常組織細胞，可促進腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)

2、移。胰腺癌是預后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，由于它的高侵襲性和高轉(zhuǎn)移率，手術治療難度大，且淋巴轉(zhuǎn)移迅速，發(fā)病率幾乎等于死亡率。研究發(fā)現(xiàn)，PAR-2在胰腺癌組織中高表達，可促進多種胰腺癌細胞的增殖，還可加速裸鼠皮下移植胰腺腫瘤的增長和轉(zhuǎn)移。正常胰腺腺泡和胰腺癌細胞均可可分泌胰蛋白酶原，胰蛋白酶原激活后成為胰蛋白酶，而胰蛋白酶卻是PAR-2最有效的激動劑，說明PAR-2很可能與胰腺癌有著密切的關系。迄今為止，國內(nèi)外對于PAR-2促進胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)

3、移機制的研究鮮見報道，而PAR-2促進胰腺癌血管生成和淋巴轉(zhuǎn)移方面的研究大多還處于在體研究階段。本研究我們采用侵襲轉(zhuǎn)移能力較強的人胰腺癌細胞株SW1990為靶細胞，初步探討PAR-2促進胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的可能的分子機制。
　　 方法：RT-PCR法和免疫細胞化學染色法檢測SW1990細胞中PAR-2mRNA及蛋白的表達情況。繪制SW1990細胞生長曲線，MTT法檢測胰蛋白酶和PAR-2激動肽SLIGKV作用前后SW1990細胞增

4、殖情況，并確定合適的各藥物濃度和作用時間。流式細胞術(FCM)檢測各實驗組細胞周期分布。Transwell小室法檢測各組細胞侵襲和遷移能力。RT-PCR法檢測胰藥物作用前后MMP-2、MMP-9、VEGF-A、VEGF-C、IL-8mRNA表達的變化。明膠酶譜法檢測胰蛋白酶和SLIGKV作用細胞前后MMP-2、MMP-9明膠酶活性的變化。ELISA法檢測藥物干預SW1990細胞8h、16h、24h、32h后分別收集各實驗組細胞上清液，檢

5、測各組細胞相對應的各個時間段上清液中VEGF-A、VEGF-C及IL-8的蛋白含量變化。
　　 結(jié)果：
　　 PAR-2在胰腺癌細胞SW1990細胞中高表達。
　　 1 RT-PCR法檢測PAR-2 mRNA表達：結(jié)果顯示SW1990細胞在基因水平表達PAR-2。且發(fā)現(xiàn)PAR-2激動肽SLIGKV及胰蛋白酶作用SW1990細胞24h后發(fā)現(xiàn)，PAR-2mRNA表達量分別為（0.645±0.038）、(0.612±0

6、.042)vs對照組(0.391±0.022)顯著增高(P＜0.05)，但PAR-2反激動肽VKGILS組PAR-2mRNA表達量為（0.413±0.040），與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2 免疫細胞化學染色法結(jié)果顯示，SW1990細胞與抗PAR-2多克隆抗體有很強的結(jié)合反應。PAR-2蛋白表現(xiàn)為棕黃色，著色主要在胞膜和胞漿，與PAR-2在細胞中的結(jié)構相符合。
　　 PAR-2激動劑對胰腺癌細胞

7、SW1990增殖的影響
　　 1細胞計數(shù)試驗及MTT法檢測PAR-2激活后對SW1990細胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定時間范圍內(nèi)，SLIGKV在1-50μmol/L、胰蛋白酶在1-10nmol/L濃度范圍內(nèi)胰腺癌細胞的增殖與藥物濃度呈正相關。當藥物濃度一定時，在1-56h時間范圍內(nèi)，胰腺癌細胞增殖與作用時間也呈正相關，且呈時間依賴性。而VKGILS始終對SW1990細胞增殖則無明顯影響。
　　 2流式細胞術檢測細胞周期分布

8、變化：10nmol/L濃度的胰蛋白酶及50umol/LSLIGKV組促進SW1990細胞細胞周期比例重新分布，加速細胞周期，其中使S期和G2/M細胞增多、使G0/G1細胞減少，對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。而VKGILS無此作用。
　　 PAR-2激動劑促進胰腺癌細胞SW1990侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　 1 Transwell小室試驗檢測SW1990細胞侵襲及遷移能力：在遷移試驗中，一定濃度的胰蛋白酶及SLIGKV作用

9、相同時間后發(fā)現(xiàn)，SW1990細胞經(jīng)變形運動通過微孔膜的細胞數(shù)明顯多于對照組與反激動肽組(100.8±12.9)(89.6±10.9)vs(43.3±9.2)(50.1±7.5)，（P＜0.01）。細胞侵襲試驗發(fā)現(xiàn)，藥物干預后SW1990細胞降解Matrigel基質(zhì)膠，進入微孔膜內(nèi)的細胞數(shù)胰蛋白酶及SLIGKV也顯著高于對照組及VKGILS組，(81.5±8.1)(71.7±5.2)vs(28.3±5.6)(32.2±7.8)，(P＜0.

10、01)。
　　 2 RT-PCR10nmol/L的胰蛋白酶及50nmol/L的SLIGKV作用24h后檢測細胞MMP-2、VEGF-A、VEGF-C、IL-8mRNA的表達量分別明顯高于對照組，具有顯著統(tǒng)計學意義，而MMP-9表達無明顯變化。
　　 3 明膠酶譜檢測MMP-2、MMP-9的明膠酶活性變化：結(jié)果顯示一定濃度的胰蛋白酶及SLIGKV作用后細胞MMP-2活性明顯高于對照組及反激動肽組(0.921±0.032)(

11、0.712±0.024)vs(0.310±0.038)(0.378±0.029)，(P＜0.01)，而MMP-9的活性無明顯變化，這與RT-PCR結(jié)果一致，（P＞0.05）。
　　 4 ELISA法檢測藥物干預8h，16h，24h，32h后，收集各時間點各組細胞上清液中VEGF-A、VEGF-C及IL-8蛋白含量變化，發(fā)現(xiàn)各時間點胰蛋白酶組及SLIGKV組三者蛋白含量均高于對照組，（P＜0.05），且呈一定的時間依賴性。

12、　　 結(jié)論：
　　 1 胰腺癌細胞SW1990在基因及蛋白水平均表達PAR-2受體，且PAR-2激動劑可在基因水平上調(diào)其表達。
　　 2 PAR-2激動劑可促進胰腺癌細胞SW1990增殖，在一定時間和濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度一時間依賴性，并且其促增殖作用和加速細胞周期進程有關。
　　 3 PAR-2激動劑可促進胰腺癌細胞SW1990浸潤和遷移，可能與上調(diào)細胞MMP-2mRNA表達，增強MMP-2明膠酶活性有關，而與M