GSH2基因沉默對胰腺癌SW1990細胞的作用.pdf

1、胰腺癌是致死率最高的腫瘤之一，五年生存率小于5％。美國在過去的5年內(nèi)，因胰腺癌每年死亡的人數(shù)超過30000人。傳統(tǒng)治療手段包括手術(shù)、放療、化療等，療效均有限。胰腺癌的早期預(yù)防、診斷、治療十分重要，亟待對其發(fā)病及進展原因的分子生物學(xué)基礎(chǔ)進行深入研究。
　　GS homeobox2(GSH2)基因，同時也稱作GSX2基因，是同源盒基因家族的一員，定位于染色體4q12，由304個氨基酸組成。GSH2基因是同源盒基因家族的一員，調(diào)控細胞的

2、增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等功能。在胚胎神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成中，GSH2協(xié)同SHH信號通路參與上述過程說明兩者聯(lián)系密切相關(guān)，SHH通路在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而GSH2在胰腺癌中的作用未見報道。
　　本實驗檢測胰腺癌組織中GSH2基因的表達情況。通過RNA干擾技術(shù)靶向沉默GSH2基因，檢測對胰腺癌SW1990細胞的增殖、遷移、侵襲等功能，吉西他濱敏感性及HH信號通路通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響。通過Co-IP技

3、術(shù)檢測在SW1990細胞中GSH2同SHH及GLI1的相互作用。
　　第一部分 GSH2基因在胰腺癌組織中的表達
　　目的:檢測胰腺癌組織中GSH2基因的表達情況。
　　方法:收集胰腺癌組織及癌旁正常組織各3例，通過HE染色、免疫組織化學(xué)染色法檢測GSH2的表達情況。以癌旁正常組織為對照，用RT-PCR法檢測GSH2基因在mRNA水平表達的差異，蛋白印跡法檢測GSH2基因在蛋白水平表達的差異。
　　結(jié)果:本部分實

4、驗中免疫組化顯示GSH2在癌組織中表達明顯強于癌旁正常組織，主要表達在胰腺癌導(dǎo)管細胞的細胞核部位。RT-PCR結(jié)果顯示癌組織中GSH2的相對表達量:8.40±0.32，癌旁組織GSH2相對表達量:0.95±0.04，提示胰腺癌癌組織中GSH2的mRNA表達量較對照組高(t=23.27，p＜0.001)。蛋白印跡法結(jié)果提示胰腺癌癌組織中GSH2的蛋白表達量較對照組高。
　　結(jié)論:GSH2基因在胰腺癌組織中高表達。
　　第二部分

5、 沉默GSH2對胰腺癌SW1990細胞增殖、遷移、侵襲、吉西他濱敏感性及HH信號通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響
　　目的:沉默GSH2對胰腺癌SW1990細胞增殖、遷移、侵襲、吉西他濱敏感性及HH信號通路關(guān)鍵分子SHH、GLI1的影響。
　　方法:用siRNA技術(shù)靶向沉默胰腺癌SW1990細胞的GSH2基因后，以轉(zhuǎn)染NC-siRNA的細胞做對照，檢測細胞增殖（CCK-8法）、遷移（Transwell法）、侵襲（Invas

6、ion Chamber法）能力變化。并聯(lián)合吉西他濱處理，檢測處理后細胞增殖及凋亡（流式細胞儀）的變化。構(gòu)建靶向沉默GSH2基因的shRNA載體質(zhì)粒，并篩選沉默效果最佳者。用siRNA及shRNA沉默GSH2基因，分別以轉(zhuǎn)染NC-siRNA及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細胞做對照。通過RT-PCR及蛋白印跡法檢測GSH2基因在mRNA及蛋白水平的沉默效率，并檢測HH信號通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1在mRNA及蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:沉默GSH

7、2基因后，細胞在450nm的吸光值為2.89±0.02，低于對照組（3.39±0.02;t=20.74，p＜0.001）;遷移透膜細胞數(shù)為157.2±6.71，低于對照組（349.3±8.33;t=17.95，p＜0.001）侵襲透膜細胞數(shù)63.21±1.16，低于對照組（95.71±3.51;t=8.79，p＜0.001）。聯(lián)合吉西他濱處理后，細胞在450nm的吸光值為2.48±0.02，低于對照組（2.89±0.02;t=17.24

8、，p＜0.001）;細胞凋亡百分為39.70％±0.52％，高于對照組（26.38％±1.17％;t=10.39，p＜0.001）。成功構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒并篩選出沉默效果最佳者。siRNA有效沉默GSH2后，RT-PCR檢測GLI1、SHH mRNA相對表達量分別為0.21±0.01、1.07±0.05，與對照組相比，Gli1 mRNA相對表達量顯著下調(diào)（1.00±0.05;t=16.69，p＜0.001）而SHH mRNA表達量變

9、化無統(tǒng)計學(xué)差異（1.00±0.02;t=1.13，p=0.32）;WB結(jié)果顯示Gli1蛋白表達明顯減少，而SHH蛋白表達無明顯改變。重組質(zhì)粒GSH2-shRNA有效沉默GSH2后，RT-PCR檢測GLI1、SHH mRNA相對表達量分別為0.18±0.004、0.97±0.07，與對照組相比Gli1 mRNA相對表達量顯著下調(diào)（0.98±0.03; t=25.72，p＜0.001）而SHH mRNA表達量變化無統(tǒng)計學(xué)差異（1.00±0.

10、02;t=0.42，p=0.70）;WB結(jié)果顯示Gli1蛋白表達明顯減少，而SHH蛋白表達無明顯改變。
　　結(jié)論:轉(zhuǎn)染GSH2-siRNA可降低胰腺癌SW1990細胞的增殖、遷移、侵襲能力，可增加對吉西他濱的敏感度。轉(zhuǎn)染GSH2-siRNA與GSH2-shRNA均可減少HH信號通路關(guān)鍵分子GLI1的mRNA及蛋白水平的表達。
　　第三部分 胰腺癌SW1990細胞中GSH2與HH信號通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1的聯(lián)系
　

11、　目的:檢測在胰腺癌SW1990細胞中GSH2與HH信號通路關(guān)鍵分子SHH及GLI1的聯(lián)系。
　　方法:獲取SW1990細胞的蛋白裂解液，采用Crosslink Magnetic Co-IP試劑盒，獲取SHH及GLI1的磁珠沉淀蛋白（pulldown蛋白），并以兔IgG為陰性對照，無處理的蛋白裂解液為陽性對照。通過免疫印跡法檢測pulldown蛋白中GSH2的表達情況。
　　結(jié)果:陽性對照中檢測出GSH2、SHH、GLI1蛋

12、白。陰性對照未檢測到蛋白。SHH磁珠沉淀蛋白中檢測到SHH、GSH2蛋白。GLI1磁珠沉淀蛋白中檢測到GLI1、GSH2蛋白。
　　結(jié)論:胰腺癌SW1990細胞中GSH2與SHH及GLI1存在蛋白間的相互作用。
　　第四部分 GSH2-siRNA裸鼠皮下瘤的體內(nèi)實驗
　　目的:檢測GSH2-siRNA對胰腺癌SW1990細胞裸鼠皮下種植瘤增殖及吉西他濱敏感性的影響
　　方法:將siRNA處理48小時后的SW199

13、0細胞種植于裸鼠右前肢背部皮下，每只接種1×107/100ul細胞懸液，將裸鼠隨機分成A組:NC-siRNA;B組:GSH2-siRNA;C組:NC-siRNA+吉西他濱;D組:GSH2-siRNA+吉西他濱。兩周后開始腹腔注射吉西他濱(100mg/kg)，每3天注射一次，連續(xù)腹腔注射2周后處死裸鼠，取出皮下瘤，記錄腫瘤體積，并觀察腹腔及胸腔轉(zhuǎn)移灶情況。
　　結(jié)果:所有裸鼠在兩周后均可成瘤，處死后腹腔及胸腔均未見轉(zhuǎn)移灶。NC-si

14、RNA組與GSH2-siRNA組的腫瘤體積無顯著差異（260.1±61.25、216.6±26.64，t=0.59，p=0.572）。聯(lián)合吉西他濱處理后，GSH2-siRNA組的腫瘤體積為74.4±16.19，小于NC-siRNA組（100.5±23.36,t=3.16,p=0.016）。
　　結(jié)論:在裸鼠皮下瘤中，沉默GSH2基因可增加胰腺癌SW1990細胞對吉西他濱的敏感性。
　　通過上述研究，本課題得出結(jié)論如下: