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文檔簡介
1、目的:
著色性干皮病C組基因(xeroderma pigmentosum group C,XPC)蛋白是核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)中最早的損傷識別因子,在DNA的損傷應(yīng)答及維持細胞遺傳穩(wěn)定性方面扮演重要角色。自噬是細胞進化過程中高度保守的一個維持穩(wěn)態(tài)的生命過程,具有降解蛋白質(zhì)及清除細胞器的能力,在生物體正常發(fā)育及應(yīng)對、處理環(huán)境威脅時發(fā)揮極為關(guān)鍵的作用。自噬同樣參與到DNA損
2、傷應(yīng)答過程中,并在DNA損傷應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。在我們早期研究中發(fā)現(xiàn),作為最早的損傷識別因子,XPC還扮演很多其他角色,但其是否參與自噬,尚未見報道。本研究將針對XPC蛋白缺失對膀胱癌細胞自噬的影響進行初步研究,以期為膀胱癌的臨床治療提供更多線索。
方法:
我們利用課題組已建好的穩(wěn)定抑制XPC蛋白表達的膀胱癌T24及HEK293細胞模型;使用氯喹(chloroquine,CQ)抑制自噬小體的降解,從而更好的觀察自
3、噬小體的積累情況;使用免疫印跡技術(shù)觀察XPC干擾前后自噬表征蛋白LC3Ⅱ的表達情況;瞬時轉(zhuǎn)染GFP-LC3,使用熒光顯微鏡觀察細胞的熒光聚集情況;CCK-8法觀察細胞的增殖情況;免疫印跡技術(shù)觀察自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達。
結(jié)果:
1.干擾XPC后,自噬小體聚集減少,GFP-LC3熒光明顯聚集的細胞比例降低;
2.使用順鉑誘導(dǎo)細胞自噬發(fā)生,發(fā)現(xiàn)干擾XPC后,自噬小體聚集減少,GFP-LC3熒光明顯聚集的細胞比
4、例降低;
3.使用順鉑持續(xù)刺激HEK293細胞,干擾XPC后LC3Ⅱ的表達趨勢發(fā)生改變:HEK293NC細胞對順鉑反應(yīng)緩慢,為逐漸上升后逐漸下降;而HEK293shXPC細胞對順鉑反應(yīng)迅速,在迅速達到高峰后逐漸下降;
4.使用順鉑持續(xù)刺激膀胱癌T24細胞,發(fā)現(xiàn)干擾XPC后LC3Ⅱ的表達趨勢發(fā)生改變:膀胱癌T24NC細胞對順鉑反應(yīng)緩慢,為逐漸上升;而膀胱癌T24shXPC細胞對順鉑反應(yīng)迅速,在迅速達到高峰后逐漸下降。<
5、br> 5.干擾XPC后,HEK293細胞對順鉑敏感性增強,DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白p-ATM(S1981)、p53表達均上調(diào);膀胱癌T24細胞對順鉑敏感性降低,DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白p-ATM(S1981)表達上調(diào)、p53表達下調(diào)。
結(jié)論:
XPC蛋白缺失后,HEK293細胞及膀胱癌T24細胞的自噬降低,同時在順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷下自噬降低,HEK293細胞對順鉑的敏感性增強,而膀胱癌T24細胞對順鉑的敏感性降低;
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