支鏈氨基酸代謝紊亂在糖尿病小鼠不同應(yīng)激下心肌易損性增加中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病正在不斷地給人類健康帶來嚴(yán)重的威脅，并且其發(fā)病率仍在逐年上升，每年死于糖尿病的患者也在不斷增加。我國(guó)是世界上面臨糖尿病威脅最大的國(guó)家，擁有糖尿病患者1.1億人，每年約有100萬人死于糖尿病。糖尿病是心血管疾病的最重要的危險(xiǎn)因素，且心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的首要死因。研究證實(shí)，糖尿病患者心血管疾病的發(fā)生率及死亡率顯著高于非糖尿病人群。以往的研究將這一作用歸結(jié)于高糖因素。然而，臨床研究表明，強(qiáng)化血糖控制并不能有效

2、改善糖尿病患者的心血管并發(fā)癥。因此，探索糖尿病相關(guān)的其他心血管疾病危險(xiǎn)因素，對(duì)于控制糖尿病患者心血管并發(fā)癥及改善糖尿病患者的生活極為重要。
　　支鏈氨基酸（BCAA）為機(jī)體必需氨基酸，是機(jī)體蛋白質(zhì)合成必要原料及調(diào)節(jié)信號(hào)。BCAA還參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及細(xì)胞自噬等眾多重要生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。此外，早在1976年，發(fā)表于JCI的研究就發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血漿BCAA水平顯著高于非糖尿病患者。研究還發(fā)現(xiàn)，心衰患者的血漿BCAA升高，

3、同時(shí)，降低心衰小鼠的支鏈氨基酸水平后，可減緩其心衰進(jìn)展。這些研究提示，BCAA代謝的異常，或許是糖尿病導(dǎo)致心血管疾病加重的重要原因。
　　另有研究結(jié)果顯示，BCAA及其代謝中間產(chǎn)物的堆積，可降低抗氧化系統(tǒng)的功能，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。此外，在肝細(xì)胞中，BCAA能夠抑制mTORC1、mTORC2及Akt的活性而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Akt在胚胎期心肌的生長(zhǎng)，高血壓導(dǎo)致的心肌肥厚及心衰過程中都起著極為重要的作用。另有實(shí)驗(yàn)證明

4、，抑制了mTORC2活性，可顯著促進(jìn)小鼠心衰的進(jìn)展。由此，我們推測(cè)， BCAA代謝障礙可能是糖尿病患者心血管疾病中心臟損傷加重的原因，其機(jī)制可能是降低其抗氧化系統(tǒng)的功能路或抑制mTORC2-Akt通路。
　　研究目的：
　　1研究支鏈氨基酸（BCAA）代謝紊亂與糖尿病相關(guān)的心肌缺血/再灌注損傷加重之間的關(guān)系及探索其潛在機(jī)制。
　　2闡明BCAA代謝紊亂對(duì)高負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響并探索其機(jī)制。
　　研究方法：

5、
　　1支鏈氨基酸代謝紊亂是否參與糖尿病相關(guān)的心肌缺血/再灌注損傷加重及相關(guān)機(jī)制研究
　　1.1用高脂飲食喂養(yǎng)并間歇低劑量鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法，誘導(dǎo)2型糖尿?。═2DM）小鼠模型。
　　1.2糖耐量實(shí)驗(yàn)（GTT）和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（TTC）檢測(cè)小鼠胰島素抵抗。
　　1.3建立小鼠心肌缺血/再灌注模型：用異氟烷吸入的方法麻醉小鼠，切開心前區(qū)皮膚及肋間肌，結(jié)扎小鼠冠脈左前降支，40分鐘后松開。
　　

6、1.4心肌點(diǎn)注射腺病毒特意的在心臟過表達(dá)目的基因。
　　1.5小動(dòng)物超聲觀察小鼠心功能。
　　1.6伊文氏藍(lán)/TTC染色檢測(cè)缺血/再灌注后心臟的梗死面積。
　　1.7 BCAA定量試劑盒檢測(cè)血漿及組織勻漿中BCAA水平。
　　1.8 DHE染色檢測(cè)組織及細(xì)胞中ROS含量。
　　1.9 TUNNEL染色和caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)組織中的細(xì)胞凋亡。
　　1.10透射電子顯微鏡觀察心肌線粒體損傷

7、。
　　1.11 H9C2細(xì)胞系的培養(yǎng)及處理。
　　1.12用H9C2缺氧復(fù)氧體外模擬心肌缺血/再灌注。
　　2探索支鏈氨基酸（BCAA）代謝紊亂對(duì)異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　2.1分離和培養(yǎng)小鼠原代心肌細(xì)胞。
　　2.2異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。
　　2.3 CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　2.4 TUNNEL染色和caspase-3活性試劑盒檢測(cè)細(xì)胞

8、凋亡。
　　2.5 Western-blot檢測(cè)目的蛋白的豐度。
　　2.6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)目的基因。
　　研究結(jié)果：
　　1支鏈氨基酸代謝紊亂通過下調(diào)MnSOD蛋白的表達(dá)和加重氧化應(yīng)激參與糖尿病相關(guān)的心肌缺血/再灌注損傷加重
　　1.1糖尿病小鼠的心肌組織PP2Cm蛋白表達(dá)水平下調(diào)。
　　1.2心肌點(diǎn)注射腺病毒過表達(dá)PP2Cm，可降低糖尿病對(duì)心肌缺血/再灌注的加重作用。
　　1.3與野生型（WT

9、）小鼠相比，PP2Cm敲除（PP2Cm-KO）小鼠心肌缺血/再灌注損傷顯著加重。
　　1.4糖尿病小鼠心臟BCAA代謝功能障礙，心臟組織中BCAA及BCKA堆積。1.5用藥物干預(yù)的方法改善糖尿病的BCAA代謝障礙后，其心肌缺血/再灌注損傷顯著改善。
　　1.6藥物干預(yù)治療PP2Cm-KO小鼠的BCAA代謝紊亂，其與WT小鼠之間的缺血/再灌注損傷差異減小。
　　1.7與WT小鼠相比，PP2Cm-KO小鼠心肌缺血/再灌注后

10、缺血邊緣區(qū)心肌細(xì)胞凋亡增加。
　　1.8與WT小鼠相比，PP2Cm-KO小鼠心肌MnSOD蛋白表達(dá)水平顯著下降；在心肌缺血/再灌注后，PP2Cm-KO小鼠ROS生成顯著高于WT小鼠。
　　1.9用丙酮酸脫氫酶激酶（BCKDK）的抑制劑（BT2）干預(yù)糾正PP2Cm-KO小鼠的BCAA代謝障礙，能恢復(fù)其心肌MnSOD蛋白表達(dá)水平；在心肌缺血/再灌注后，治療后的PP2Cm-KO小鼠（PP2Cm-KO+BT2）ROS生成量較未治療的

11、PP2Cm-KO小鼠（PP2Cm-KO+Vehicle）顯著減少，線粒體損傷顯著減輕。
　　1.10 BCKA孵育能下調(diào)H9C2細(xì)胞MnSOD蛋白的表達(dá)，增加 H9C2細(xì)胞的缺氧復(fù)氧后ROS的生成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低存活率。
　　2探索支鏈氨基酸（BCAA）代謝紊亂對(duì)異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　2.1 BCKA孵育能夠增加ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，降低其存活。
　　2.2 BCKA能夠抑制

12、降低mTORC2復(fù)合物的關(guān)鍵組成分子rictor的表達(dá)，降低mTORC2的酶活性，從而抑制心肌細(xì)胞中Akt的激活。
　　2.3過表達(dá)rictor蛋白以抵抗BCKA對(duì)心肌rictor的下調(diào)作用，增加mTORC2的酶活性，可抑制BCKA對(duì)心肌凋亡的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：
　　1.2型糖尿病小鼠心肌BCAA代謝紊亂，是糖尿病相關(guān)的心肌缺血/再灌注損傷加重的原因，其機(jī)制是：BCAA及其代謝中間產(chǎn)物降低了心肌抗氧化酶