蜜蜂、家蠶ADAR基因克隆和在畢赤酵母中表達(dá)研究及昆蟲鈉離子通道基因克隆、選擇性剪切及RNA編輯分析.pdf

1、真核生物前體RNA需要經(jīng)過一系列的轉(zhuǎn)錄后加工才能形成成熟的mRNA,這些加工過程包括選擇性剪接、RNA編輯以及RNA 3'端多聚腺苷酸化等過程。其中有一種RNA編輯作用是由腺嘌呤脫氨酶(ADARs)介導(dǎo)的,被稱為A至I RNA編輯。ADARs是一種RNA編輯酶,作用于雙鏈RNA(dsRNA)上的腺嘌呤,通過水解脫氨作用使腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤。像其它雙鏈RNA結(jié)合蛋白一樣,ADARs可以非特異性地結(jié)合到雙鏈RNA上,一旦結(jié)合到雙鏈RNA后

2、,ADARs可以高效地使特定位點(diǎn)上的腺嘌呤脫氨基。大多數(shù)酶將腺嘌呤脫氨產(chǎn)物次黃嘌呤識別成為鳥嘌呤,在翻譯過程中次黃嘌呤被當(dāng)作鳥嘌呤,這樣ADAR5就改變了RNA的原始序列信息。此外,由于次黃嘌呤與胞嘧啶配對,ADARs還可把AU堿基轉(zhuǎn)變?yōu)镮U堿基對,改變RNA的空間結(jié)構(gòu)。 1.蜜蜂、家蠶腺嘌呤脫氨酶的克隆及蜜蜂ADAR基因畢赤酵母表達(dá)研究本研究在蜜蜂中克隆到ADAR基因全長序列(AmADAR),并在家蠶中得到部分序列,通過多序列

3、對比分析發(fā)現(xiàn)與黑腹果蠅有47.41％相似性,并發(fā)現(xiàn)蜜蜂ADAR基因的表達(dá)受到選擇性剪切的調(diào)控,在不同的發(fā)育階段(卵,幼蟲、蛹、成蟲)表達(dá)量也有所差異,具體表現(xiàn)為在成蟲中表達(dá)量最高,卵中次之,幼蟲中表達(dá)量較低,蛹中表達(dá)量最低,家蠶ADAR在蛹中表達(dá)量最高,幼蟲中次之,成蟲中表達(dá)量較低,卵中表達(dá)量最低。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蜜蜂和家蠶ADAR的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。 我們構(gòu)建重組載體在畢赤酵母中表達(dá)蜜蜂ADAR基因,采用電轉(zhuǎn)化的方法將重組表

4、達(dá)載體pSK-FLIS6-AmADAR轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的酵母細(xì)胞的基因組中,然后采用營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基及PCR的方法篩選陽性酵母轉(zhuǎn)化子His+,再利用MM和MD培養(yǎng)基篩選甲醇利用慢型菌落Muts。將His+Muts型轉(zhuǎn)化子接種于BMGY培養(yǎng)基獲得生物量的菌體后,再用含0.5％甲醇的BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Western blot鑒定。結(jié)果顯示表達(dá)蛋白的分子量約為70KD。 2.昆蟲鈉離子通道基因選擇性剪

5、切和RNA編輯研究電壓門控鈉離子通道是與電興奮性細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位有關(guān)的大跨膜蛋白,在昆蟲中鈉離子通道基因的轉(zhuǎn)錄本受到RNA編輯和選擇性剪切調(diào)控。在本研究中,我們在蜜蜂,家蠶,赤擬谷盜和果蠅D.ananassae中鑒定到全長鈉離子通道基因。在蜜蜂中有10個(gè)編輯位點(diǎn)(這些編輯位點(diǎn)均造成氨基酸的變化);在家蠶中有5個(gè)編輯位點(diǎn)(其中4個(gè)造成氨基酸的變化);在果蠅D.ananassae中有6個(gè)編輯位點(diǎn)(其中4個(gè)造成氨基酸的變化)。另外,我們發(fā)現(xiàn)在

6、蜜蜂鈉離子通道基因Am-para中有6個(gè)選擇性剪切外顯子,其中有2個(gè)與黑腹果蠅相同；在家蠶鈉離子通道基因Bm-para中有9個(gè)選擇性剪切外顯子,其中有8個(gè)與黑腹果蠅相同；赤擬谷盜鈉離子通道基因Tc-paral中有1個(gè)選擇性剪切外顯子,Tc-para2中有4個(gè)選擇性剪切外顯子；果蠅D.ananassae鈉離子通道基因中有10個(gè)選擇性剪切外顯子,其中有10個(gè)與黑腹果蠅相同,有一個(gè)選擇性外顯子在果蠅,蜜蜂,赤擬谷盜中均存在。 有趣的是