LfcinB與牛乳鐵蛋白N-lobe基因的克隆及N-lobe在畢赤酵母中表達的研究.pdf

1、乳鐵蛋白(LF)是由哺乳動物乳腺和其他外分泌腺產(chǎn)生的一種鐵結合糖蛋白,廣泛存在于乳汁、唾液、眼淚等分泌物中,它具有抗病毒、殺菌、免疫調(diào)節(jié)、基因轉錄活化等多種生物學活性。隨著乳鐵蛋白被普遍關注和廣泛重視,人們發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白是常見高等哺乳動物分泌的乳鐵蛋白中生物活性最強的,并且多種動物乳鐵蛋白的許多生物學功能都與它們的N-端(N-lobe)密切相關,特別是與其N-端的乳鐵蛋白素(Lfcin)相關。 畢赤酵母是近年來發(fā)展起來的一種新型

2、酵母表達系統(tǒng),它兼有原核細胞的生長特性和分子遺傳背景,又有真核生物的特性,可以對外源蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)糖基化、二硫鍵形成等翻譯后修飾,在過去的20年中已經(jīng)有超過300種不同的蛋白質(zhì)在畢赤酵母中實現(xiàn)了成功表達。 目的：本實驗擬通過基因工程技術建立一個體外高效表達系統(tǒng)。為深入的了解牛乳鐵蛋白N-端基因和牛乳鐵蛋白素(LfcinB)基因的生物學活性和應用發(fā)展空間,為該蛋白的以后研究提供基礎。 方法：從泌乳期奶牛的乳腺組織中提取其

3、總RNA,根據(jù)GenBank中已經(jīng)報道的牛乳鐵蛋白的mRNA(NO:NM 180998)合成引物,運用RT-PCR的方法克隆了LfcinB和牛乳鐵蛋白N-lobe堿基序列,將這二者克隆到pGM-T載體上并對其進行酶切和測序鑒定,測序正確的被分別命名為pGM-LfcinB和pGM-N-lobe。挑取pGM-N-lobe菌株放大培養(yǎng)提取質(zhì)粒后用EcoR I和Xba I雙酶切切下牛乳鐵蛋白N-lobe,與此同時用EcoR I和Xba I雙酶切

4、的畢赤巴斯德酵母分泌表達載體pPICZαA,在T4 DNA連接酶的作用下使二者連接,經(jīng)酶切鑒定和序列測定確認N-lobe堿基序列插入多克隆位點并且開放性閱讀框正確后,Sac I線性化重組質(zhì)粒,用電擊的方法轉入畢赤酵母GS115中。30℃培養(yǎng)數(shù)天后從YPDS平板上挑取具有ZeocinTM抗性的克隆,對比在MM和MD平板上的生長情況確定轉化子的表現(xiàn)型。Lyticase酶裂解酵母細胞,以裂解后暴露的酵母基因組為模板,采用PCR方法確認有N-l

5、obe基因整合到酵母基因組中。將鑒定有N-lobe基因整合酵母轉化子接種到BMGY/BMMY培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),用甲醇誘導,收集誘導不同時間的上清和細胞沉淀,用三氯醋酸(TCA)沉淀上清,用SDS-PAGE和抑菌實驗兩種方法檢測目的蛋白的表達情況。 結果：將這兩段堿基序列分別克隆入pGM-T載體測序結果表明：前者長87bp與參考序列(登錄號為:NM 180998)的同源性為100％；后者長1028bp與參考序列的同源性為99.7％