CD82胞外小環(huán)結構域抑制腫瘤細胞遷移及誘導凋亡的機理的研究.pdf

1、CD82蛋白是抑癌基因KAI1編碼的細胞膜糖蛋白，屬于四跨膜蛋白超家族(transmembrane4 superfamily TM4SF)成員之一，其主要生物學功能是參與細胞的聚集、粘附、遷移以及調控。CD82在正常機體組織廣泛表達，在腫瘤組織表達下降或不表達。大量研究結果表明，CD82可抑制多種組織來源的腫瘤細胞體外遷移和體內(nèi)轉移，被認為是廣譜的腫瘤轉移抑制因子。對其作用機制的研究日益受到重視。
　　CD82由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞

2、內(nèi)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)形成一個小環(huán)(smallextracellular loop，SEL)和一個大環(huán)(large extracellular loop，LEL);跨膜區(qū)為四個疏水的肽段;胞內(nèi)區(qū)包括N-端、C-端和一個細胞內(nèi)環(huán)。對CD82蛋白不同結構域的作用進行研究，對闡明其抑制腫瘤轉移的分子機理具有十分重要的理論意義。目前，對CD82胞外區(qū)大環(huán)結構的功能研究較多，對CD82胞外區(qū)小環(huán)結構功能的研究很少，其功能尚不明確。為弄清楚CD82

3、胞外小環(huán)結構域在CD82抑制腫瘤轉移中的作用，本論文采用化學方法合成CD82-SEL氨基酸序列模擬肽(CD82-SEL-P)，對其在細胞遷移、生長及凋亡中的作用進行了研究。
　　1.CD82-SEL-P對貼壁生長、體外遷移運動等的影響。
　　采用劃痕法、Boyden小室培養(yǎng)法，觀察了CD82-SEL-P對不同組織來源的腫瘤細胞貼壁生長、體外遷移運動等的影響。
　　實驗結果:(1)發(fā)現(xiàn)CD82-SEL-P可顯著抑制各種貼

4、壁生長的腫瘤細胞的遷移運動，其抑制作用與處理濃度呈正相關。(2)發(fā)現(xiàn)CD82-SEL-P可顯著抑制細胞的貼壁，轉而聚團懸浮生長，其抑制細胞貼壁能力與處理濃度呈正相關。(3)發(fā)現(xiàn)CD82-SEL-P促進懸浮生長的細胞聚團生長。
　　結論:CD82-SEL-P能抑制體外培養(yǎng)的貼壁細胞遷移運動;抑制貼壁生長細胞的貼壁，轉而聚團懸浮生長;促進懸浮生長的細胞聚團生長。且抑制作用均與處理濃度呈正相關。說明CD82-SEL可能是CD82與腫瘤轉

5、移抑制有關的重要結構域，并且獨立的CD82-SEL就有腫瘤轉移抑制的功能。這一結論尚屬首次報道。
　　2.CD82-SEL-P對腫瘤細胞生長、增殖的影響。
　　采用細胞熒光組化及MTT法檢測了CD82-SEL-P對不同腫瘤細胞生長及形態(tài)的影響。
　　實驗結果:(1)CD82-SEL-P可使培養(yǎng)腫瘤細胞收縮、胞漿出現(xiàn)顆粒、空泡，細胞與培養(yǎng)板剝離脫落。(2)CD82-SEL-P可以抑制各種貼壁培養(yǎng)腫瘤細胞的生長、增殖，其抑

6、制作用呈濃度依賴性。(3)CD82-SEL-P促進懸浮生長細胞的生長、增殖。
　　結論:CD82-SEL-P對貼壁生長細胞和懸浮生長的細胞作用相反。CD82-SEL-P抑制體外培養(yǎng)的貼壁細胞的生長增殖，促進懸浮生長細胞的生長增殖。
　　3.以生物素標記的CD82-SEL-P做探針，采用Western blot等技術分別檢測了CD82-SEL-P可能結合的膜蛋白和膜脂，以確定與CD82-SEL-P結合的靶分子。
　　實驗

7、結果:(1)Western blot結果顯示，生物素標記的CD82-SEL-P探針可識別結合的蛋白有數(shù)十條之多且均為膜蛋白。(2)生物素標記的CD82-SEL-P可結合到細胞總脂包被的硅膠小球，說明CD82-SEL-P識別結合的靶分子有脂類成份。
　　結論:CD82-SEL-P識別結合的特異結構是寡糖鏈，其靶分子不是某個特異的蛋白或脂類分子，而是多個分子;包括糖蛋白和糖脂。
　　4.CD82-SEL-P誘導SW620和MDA

8、-MB-231腫瘤細胞凋亡以及機制研究。
　　觀察了CD82-SEL-P對SW620和MDA-MB-231腫瘤細胞凋亡的影響，并對其機制進行了初步探討。
　　實驗結果:(1)細胞組化結果顯示，CD82-SEL-P可誘導SW620和MDA-MB-231腫瘤細胞凋亡。(2)Western Blot分析結果顯示，CD82-SEL-P處理可增加SW620和MDA-MB-231腫瘤細胞Caspase3和Caspase8的表達。(3)C

9、D82-SEL-P誘導SW620細胞凋亡同時發(fā)生線粒體膜電位的下降，提示CD82-SEL-P誘導SW620細胞凋亡可能牽涉到線粒體凋亡途徑。(4)CD82-SEL-P誘導MDA-MB-231細胞凋亡同時有Caspase12和GRP78表達增高，提示CD82-SEL-P誘導MDA-MB-231細胞凋亡可能牽涉到內(nèi)質網(wǎng)凋亡途徑。
　　結論:(1)CD82-SEL-P可誘導SW620和MDA-MB-231細胞的凋亡。(2)CD82-SE