白念珠菌ADH1缺失株對氟康唑的MIC及其外排泵相關(guān)機制的初步研究.pdf

1、目的:
　　探討白念珠菌（Candida albicans）ADH1（alcohol dehydrogenase I）基因缺失后對氟康唑（fluconazole。FLC）的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的影響，并進而探討其變化是否與外排泵機制相關(guān)。
　　方法:
　　以白念珠菌SC5314株、以其為親本構(gòu)建的白念珠菌ADH1基因缺失株EX2與回復(fù)株RE1為研究對象

2、，按照美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）M27-A3方案的微量稀釋法測定FLC作用對這三株白念珠菌酵母相的MIC水平，以考察ADH1基因缺失后菌細(xì)胞對FLC的體外敏感性變化；并同時通過瓊脂點板實驗（spot assay）測定菌細(xì)胞對FLC的藥物敏感性變化，以比較其在固體培養(yǎng)基上的結(jié)果與上述MIC值是否一致。通過羅丹明123的蓄積/外排實驗測定FLC

3、存在時三株菌株外排泵功能差異；并通過RT-PCR技術(shù)測定FLC作用對菌株外排泵相關(guān)基因（CDR1、CDR2、MDR1）在mRNA水平的表達情況差異，以考察ADH1基因缺失對白念珠菌外排泵功能及主要外排泵耐藥基因表達的影響。通過檢測線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)ATP水平初步考察ADH1基因敲除后對FLC敏感性的影響是否與能量代謝相關(guān)。
　　結(jié)果：
　　1.微量稀釋法結(jié)果顯示，白念珠菌ADH1缺失株EX2對FLC的MIC較親本株SC53

4、14及回復(fù)株RE1均降低，其中72小時后MIC50、MIC80均下降兩個梯度，48小時后MIC50、MIC80均下降一個梯度；親本株SC5314與回復(fù)株RE1之間對FLC的MIC50、MIC80在48小時、72小時均無差異。瓊脂點板實驗結(jié)果亦顯示，ADH1缺失株EX2對FLC的敏感性較親本株SC5314、回復(fù)株RE1升高，親本株SC5314與回復(fù)株RE1之間對FLC的敏感性無明顯差異。
　　2.蓄積實驗后，缺失株EX2細(xì)胞內(nèi)羅丹明

5、123陽性細(xì)胞百分比分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的2.09倍及1.67倍(P<0.05)，EX2對羅丹明123的蓄積增加；外排實驗后，缺失株EX2細(xì)胞內(nèi)的羅丹明123陽性細(xì)胞百分比分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的2.27倍及2.13倍（P<0.05），EX2對羅丹明123的外排減少。親本株SC5314及回復(fù)株RE1之間對羅丹明123的蓄積與外排均無明顯差異（P>0.05）。
　　3. RT-PCR結(jié)果表明，ADH

6、1缺失株EX2 MDR1基因在mRNA水平的表達分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的0.32倍、0.29倍(P<0.05)，CDR2基因在mRNA水平的表達分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的3.10倍、2.12倍(P<0.05),CDR1基因在mRNA水平的表達分別為親本株SC5314及回復(fù)株RE1的1.42倍及1.18倍（P>0.05）。缺失株EX2中外排泵基因CDR2表達上升，MDR1表達下降，CDR1基因表達無明顯差異。

7、親本株SC5314與回復(fù)株RE1之間外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1在mRNA水平的表達均無明顯差異（P>0.05）。
　　4. ADH1缺失株EX2、親本株SC5314、回復(fù)株RE1的線粒體膜電位熒光比值分別為7.93、12.84、11.47，其中缺失株EX2較親本株SC5314及回復(fù)株RE1線粒體膜電位均降低(P<0.05)，親本株SC5314與回復(fù)株RE1線粒體膜電位無明顯差異(P>0.05)。
　　5. ADH

8、1缺失株EX2、親本株SC5314、回復(fù)株RE1細(xì)胞內(nèi)ATP水平分別為374.51 nM、568.82 nM、517.94 nM，缺失株EX2細(xì)胞內(nèi)ATP水平較親本株SC5314和回復(fù)株RE1均降低（P<0.05），親本株SC5314與回復(fù)株RE1的細(xì)胞內(nèi)ATP水平無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論:ADH1基因可能是參與白念珠菌對氟康唑耐藥的基因，其機制可能與通過影響細(xì)胞內(nèi)ATP水平及線粒體膜電位，進而上調(diào)外排泵基因MDR1