HIPK2調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖與凋亡的作用研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是一個(gè)多步驟、復(fù)雜的漸進(jìn)過程，其中神經(jīng)干細(xì)胞作為整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中各種類型神經(jīng)細(xì)胞的唯一來源，在大腦結(jié)構(gòu)形成和神經(jīng)功能完整性的建立中占據(jù)重要的地位。既往研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)干細(xì)胞增殖、自我更新及分化過程中，Notch信號(hào)通路發(fā)揮重要作用，然而其具體機(jī)制尚未完全闡明。近年來有研究發(fā)現(xiàn)同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2（HIPK2）可能與Notch信號(hào)通路相互作用參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞分化過程。本課題組前期對(duì)小鼠腦組織中Notch

2、信號(hào)下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J進(jìn)行特異性敲除，通過基因芯片檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：在特異性阻斷Notch信號(hào)通路后，Hipk2表達(dá)下調(diào)。由此我們推測(cè)Hipk2可能在Notch信號(hào)的調(diào)節(jié)下發(fā)揮調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及凋亡的作用。本研究擬運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)體系和研究方法，探索Hipk2對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及凋亡的影響及Notch信號(hào)對(duì)Hipk2的調(diào)控作用，為進(jìn)一步揭示神經(jīng)干細(xì)胞增殖、自我更新及分化機(jī)制開辟新的視角。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　?。?）利用

3、實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)神經(jīng)干/祖細(xì)胞系（C17.2細(xì)胞）、原代神經(jīng)干細(xì)胞及原代神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天后細(xì)胞內(nèi)Hipk2的表達(dá)。運(yùn)用原位雜交實(shí)驗(yàn)，觀察胚胎12.5及14.5天胎鼠大腦組織和視網(wǎng)組織中Hipk2的表達(dá)。
　?。?）運(yùn)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建PCAG-Hipk2-IRES-EGFP質(zhì)粒，并通過菌液PCR反應(yīng)和雙酶切反應(yīng)對(duì)構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后公司測(cè)序。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將Hipk2表達(dá)質(zhì)粒（PCAG-Hipk2

4、-IRES-EGFP）和載體質(zhì)粒（PCAG-IRES-EGFP）分別轉(zhuǎn)染入C17.2細(xì)胞過表達(dá)48小時(shí)后，采用MTT比色法、流式細(xì)胞周期檢測(cè)技術(shù)、細(xì)胞Ki67免疫熒光染色及細(xì)胞Edu摻入實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Hipk2對(duì)C17.2細(xì)胞增殖的影響，并通過細(xì)胞流式凋亡檢測(cè)技術(shù)和Western blot技術(shù)，檢測(cè)Hipk2對(duì)C17.2細(xì)胞凋亡的影響。
　　（3）利用實(shí)時(shí)定量PCR方法和Western blot技術(shù)，分別檢測(cè)25μM和75μM Not

5、ch抑制劑GSI干預(yù)C17.2細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)Hipk2的表達(dá)。利用TRANSFAC，NCBI，promoter scan等軟件分析Hipk2啟動(dòng)子中可能存在的Notch信號(hào)作用位點(diǎn)（如RBP-J、Hes等）。為明確Notch信號(hào)通路對(duì)Hipk2的調(diào)節(jié)作用，運(yùn)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建PGL3-Basic-Hipk2-promoter質(zhì)粒，并通過菌液PCR反應(yīng)和雙酶切反應(yīng)對(duì)構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行鑒定后公司測(cè)序。在此基礎(chǔ)上利用細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

6、技術(shù)，將PGL3-Basic-Hipk2-promoter質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK分別轉(zhuǎn)染至神經(jīng)干/前體細(xì)胞系（C17.2細(xì)胞），小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系（HT-22細(xì)胞），人腎上皮細(xì)胞系（293T細(xì)胞），小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系（3T3細(xì)胞），通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)不同細(xì)胞中Hipk2的螢光素酶活性。進(jìn)一步利用細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將PCAG-NICD-GFP質(zhì)粒、PGL3-Basic-Hipk2-promoter質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒pRL

7、-TK、工具質(zhì)粒PCAG-GFP共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞和C17.2細(xì)胞，檢測(cè)兩種細(xì)胞中Notch受體胞內(nèi)段（NICD）作用后Hipk2的熒光素酶活性，并運(yùn)用同樣的實(shí)驗(yàn)方案和方法分別檢測(cè)Notch通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J、Notch下游基因Hes1作用后Hipk2的熒光素酶活性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　?。?）實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干/祖細(xì)胞系（C17.2細(xì)胞）、原代神經(jīng)干細(xì)胞及原代神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天后細(xì)胞內(nèi)均存在Hip

8、k2的表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)與原代神經(jīng)干細(xì)胞相比，Hipk2在原代神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天后表達(dá)降低。胎鼠大腦及視網(wǎng)膜原位雜交結(jié)果顯示，Hipk2廣泛表達(dá)于胎鼠大腦和視網(wǎng)膜組織，且在大腦腦室下帶以及視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中表達(dá)較強(qiáng)。
　?。?）運(yùn)用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建Hipk2表達(dá)序列質(zhì)粒（PCAG-Hipk2-IRES-EGFP）后，MTT、流式細(xì)胞周期檢測(cè)以及細(xì)胞Ki67免疫熒光染色及細(xì)胞Edu摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果均顯示，與

9、載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，Hipk2過表達(dá)后能夠抑制C17.2細(xì)胞增殖。流式凋亡檢測(cè)和活化caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示Hipk2能夠促進(jìn)C17.2細(xì)胞凋亡。
　?。?）實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（DMSO干預(yù)）相比，GSI干預(yù)組細(xì)胞中Hipk2在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)均降低。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件TRANSFAC，NCBI及promoter scan等綜合分析Hipk2啟動(dòng)子序

10、列后，結(jié)果顯示Hipk2啟動(dòng)子區(qū)存在2個(gè)RBP-J結(jié)合位點(diǎn)（GTGGGAA、TTCCCAC），9個(gè)Hes1結(jié)合位點(diǎn)即N-box位點(diǎn)（CACNAG）。運(yùn)用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建PGL3-Basic-Hipk2-promoter質(zhì)粒后，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示在HT-22細(xì)胞、3T3細(xì)胞、293T細(xì)胞及C17.2細(xì)胞中Hipk2的表達(dá)存在差異，為此我們選取Hipk2表達(dá)較高的293T細(xì)胞和表達(dá)較高且具有神經(jīng)特異性的C17.2細(xì)胞作為

11、我們下述研究的細(xì)胞基礎(chǔ)。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分別檢測(cè)NICD、RBP-J、Hes1對(duì)Hipk2啟動(dòng)子調(diào)節(jié)作用的結(jié)果顯示，NICD和RBP-J均能作用于Hipk2，激活其啟動(dòng)子的表達(dá)。在293T細(xì)胞中Hes1能較強(qiáng)的抑制Hipk2啟動(dòng)子的表達(dá)，使其表達(dá)降低，然而在C17.2細(xì)胞中這種抑制作用并不明顯。
　　結(jié)論：
　?。?）Hipk2在神經(jīng)干/祖細(xì)胞系和原代神經(jīng)干細(xì)胞及胎鼠大腦、視網(wǎng)膜中均高表達(dá)。
　?。?）體外過