丹蔞片對(duì)ApoE---小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種原因尚不完全清楚的慢性血管病變，以血管壁上脂質(zhì)沉積、纖維斑塊、粥樣斑塊形成，嚴(yán)重時(shí)斑塊破裂、血栓形成為其主要特征。動(dòng)脈斑塊可導(dǎo)致血管狹窄甚至完全堵塞，最終導(dǎo)致相應(yīng)臟器缺血乃至梗死為標(biāo)志。目前其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床治療缺乏明確有效的作用靶點(diǎn)，這也給AS的治療帶來極大的困難。
　　中醫(yī)學(xué)古書記載中雖無直接與AS對(duì)應(yīng)的病名，但據(jù)其臨床癥狀，可表現(xiàn)為中醫(yī)的頭暈、頭痛、胸

2、痹、中風(fēng)等。目前中醫(yī)對(duì)AS的病因病機(jī)認(rèn)識(shí)相對(duì)集中，認(rèn)為AS的基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，痰瘀互結(jié)。丹萎片(Dan Lou Tablet，DLT)是在痰瘀同治理論指導(dǎo)下的代表藥物，以逐瘀豁痰、益氣通痹為法組方。前期研究發(fā)現(xiàn)，活血化痰中藥DLT具有良好的抗AS療效，但其作用機(jī)制尚未闡明。巨噬泡沫細(xì)胞形成在AS發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。目前尚無針對(duì)DLT與巨噬細(xì)胞泡沫化的關(guān)系開展對(duì)抗AS的作用研究，為進(jìn)一步探討DLT對(duì)AS的干預(yù)作用，

3、本實(shí)驗(yàn)依托國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.81202782)進(jìn)行設(shè)計(jì)。
　　目的：
　　通過本研究，希望能夠明確DLT對(duì)AS巨噬細(xì)胞泡沫化影響的確切作用，重點(diǎn)探討巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36、血凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(Lectin likeoxidized low density lipoprotein receptor1，LOX-1)與三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP binding cassette transp

4、orter A1，ABCA1)在AS巨噬細(xì)胞泡沫化中的作用機(jī)制和丹蔞片對(duì)AS巨噬細(xì)胞泡沫化和炎癥的作用機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.丹蔞片對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型形成的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、丹蔞片低劑量組(DLT-L)、丹蔞片中劑量組(DLT-M)、丹萎片高劑量組(DLT-H)、阿托伐他汀組(LPT)。以正常飲食的ApoE-/-小鼠作

5、為空白對(duì)照，以阿托伐他汀組(LPT)作為陽性對(duì)照。每組樣本量均為10只。
　　處理方法:應(yīng)用經(jīng)典的AS模型——單純高脂飼料長周期喂養(yǎng)誘導(dǎo)AS小鼠模型，選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠，高脂飼料喂養(yǎng)16周，各干預(yù)組在開始高脂飼料喂養(yǎng)時(shí)即給予相應(yīng)的處理。DLT-L、DLT-M、DLT-H三組按照動(dòng)物與人體間的等效劑量換算公式將DLT換算成小鼠劑量，分別給予DLT超微粉溶液1、2、4g/kg/d; LPT陽性對(duì)照組參照文獻(xiàn)給予2mg/k

6、g/d; Control、Model組給予生理鹽水2ml/kg/d。每天灌胃1次，連續(xù)16周。
　　2.丹蔞片對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組:(1) THP-1源性巨噬細(xì)胞，分為模型組(Model)，丹蔞片低劑量組(DLT20)，丹蔞片中劑量組(DLT1000)，丹萎片高劑量組(DLT2000)，DLT干預(yù)單位為μg/ml;(2) RAW264.7巨噬細(xì)胞，分為空白對(duì)照組(Control)，模型組(Model)，丹蔞片

7、各劑量組(DLT20、DLT100、DLT500、DLT1000、DLT1500、DLT1750、DLT2000、DLT2250、DLT2500)，DLT干預(yù)單位為μg/ml。
　　處理方法:(1)利用佛波酯(PMA)刺激THP-1細(xì)胞貼壁形成巨噬細(xì)胞，再加氧化低密度脂蛋白50μ g/ml刺激構(gòu)建巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型。Model組不加藥物干預(yù)，DLT干預(yù)組加相應(yīng)的DLT超微粉溶液，使其終濃度為DLT20，DLT1000，DLT

8、2000; ox-LDL和DLT是同時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，孵育培養(yǎng)24h。(2) RAW264.7巨噬細(xì)胞，Control組即不加oxLDL也不加DLT干預(yù)，余組均加oxLDL或紅色熒光DiI標(biāo)記的氧化低密度脂蛋白刺激，Model組不加DLT干預(yù)，DLT各干預(yù)組加相應(yīng)的DLT超微粉溶液，使其總濃度為DLT20、DLT100、DLT500、DLT1000、DLT1500、DLT1750、DLT2000、DLT2250、DLT2500，ox-

9、LDL或DiI-oxLDL和DLT是同時(shí)加入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，加ox-LDL時(shí)孵育培養(yǎng)24h，加DiI-oxLDL分別孵育2h、4h、6h和24h。
　　3.丹蔞片對(duì)小鼠AS炎癥的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、丹蔞片低劑量組(DLT-L)、丹蔞片中劑量組(DLT-M)、丹蔞片高劑量組(DLT-H)、阿托伐他汀組(LPT)。以正常飲食的ApoE-/-小鼠作為空白對(duì)照，以阿托伐他汀組(LPT

10、)作為陽性對(duì)照。每組樣本
　　處理方法:應(yīng)用經(jīng)典的AS模型——單純高脂飼料長周期喂養(yǎng)誘導(dǎo)AS小鼠模型，選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠，高脂飼料喂養(yǎng)16周，各干預(yù)組在開始高脂飼料喂養(yǎng)時(shí)即給予相應(yīng)的處理。DLT-L、DLT-M、DLT-H三組按照人每天臨床劑量換算成小鼠劑量，分別給予DLT超微粉溶液1、2、4g/kg/d; LPT陽性對(duì)照組參照文獻(xiàn)給予2mg/kg/d;Control、Model組給予生理鹽水2ml/kg/d。每天灌

11、胃1次，連續(xù)16周。
　　結(jié)果：
　　1.丹蔞片對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型形成的影響
　　小鼠一般情況、體重變化情況:各組小鼠精神、毛色變化等方面差異變化不大。各組小鼠喂養(yǎng)時(shí)間與各組體重變化成正相關(guān)，;實(shí)驗(yàn)開始前，各組體重組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明體重基線一致;實(shí)驗(yàn)第8周開始到第16周時(shí)，DLT-H組均較Control組變輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義9;而實(shí)驗(yàn)第12周開始，DLT-H組與Model組相比，差異

12、亦有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;實(shí)驗(yàn)第16周時(shí)，DLT-M組與Model組比較時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DLT能控制ApoE-/-小鼠體重的增加，并呈劑量依賴性。
　　小動(dòng)物超聲評(píng)價(jià)頸動(dòng)脈AS形成情況:Control組的頸動(dòng)脈血管聲影均勻連續(xù)，管腔無見異常聲影;Model組大部分小鼠的頸動(dòng)脈血管聲影不均勻連續(xù)，與周圍組織（甲狀腺為參照物）相比，部分血管壁呈強(qiáng)回聲光影，表明血管明顯增粗增厚，甚者有異常聲影浮凸于血管壁，以頸動(dòng)脈分叉處明

13、顯多見;DLT-L組的頸動(dòng)脈亦可見到不均勻連續(xù)的強(qiáng)回聲光影;DLT-M、DLT-H組及LPT組情況逐漸改善減輕。
　　HE染色觀察血管病理形態(tài)學(xué)的變化:Model組主動(dòng)脈血管壁可見比較典型的斑塊形成，血管的內(nèi)皮細(xì)胞脫落明顯，大面積的斑塊沉積附著在血管內(nèi)壁，甚至突出管腔，內(nèi)彈力板尚且完整，內(nèi)膜明顯增生增厚，鏡下可見大量巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)而形成的泡沫細(xì)胞，中膜、外膜平滑肌細(xì)胞增生遷移，不規(guī)則增厚，亦可見散在的泡沫細(xì)胞浸潤，說明小鼠AS造

14、模成功;與Model組比較，DLT各組及LPT組小鼠的主動(dòng)脈AS病變泡沫細(xì)胞浸潤逐步減少，DLT-H組及LPT組的管壁內(nèi)皮細(xì)胞尚連續(xù)，中外膜與Control組厚度相當(dāng)，較Model組薄。結(jié)果顯示DLT呈劑量依賴性的減少斑塊形成，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖重構(gòu)。
　　2.丹蔞片對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響
　　細(xì)胞生長記錄情況:Model組比Control組細(xì)胞指數(shù)小，說明形成泡沫細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞指數(shù)下降。加入DLT之后細(xì)胞指數(shù)明顯高于M

15、odel組，表明DLT能明顯抑制泡沫細(xì)胞形成。
　　流式分析泡沫細(xì)胞內(nèi)的MFI值:結(jié)果提示DLT中劑量及高劑量各組跟Model組相比，從孵育2h開始便能明顯降低MFI，P＜0.05，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且自DLT500μ g/ml起，MFI峰值逐漸往左移動(dòng)，即MFI逐漸下降，并呈劑量依賴，時(shí)間依賴。
　　CD36的mRNA表達(dá):與Control相比，Model組的CD36的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增多，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、意義（P＜0.01）;與Model組相比，DLT2000組的CD36的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯減少，差異亦有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.丹萎片對(duì)小鼠AS炎癥的影響
　　小鼠脾細(xì)胞懸液中Th1-IFNγ的百分比含量:與Control組相比，Model組的Th1-IFNγ的百分比含量明顯升高，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Model組相比，DLT-L組無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DLT-M、DLT-H組的Th1-IFNγ

17、的百分比含量均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與Model組相比，LPT組的Th1-IFNγ的百分比含量均明顯下降，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　TNF-α蛋白信號(hào)的表達(dá):各組的TNF-o蛋白信號(hào)值均大于200，Model組與DLT-H組比較，倍數(shù)變化為1.496，表明DLT-H組干預(yù)后炎癥因子TNF-α的表達(dá)有明顯的差異。
　　IFN-γ蛋白信號(hào)的表達(dá):各組的IFN-γ蛋白信號(hào)值均大于200，Model組與DLT-H組比較，倍